關註公眾號“醫學科研小坑”，瞭解更多相關科研技術內容！
免疫熒光（Immunofluorescence）：簡稱IF，與western blotting一樣，也是根據抗原抗體反應的原理，將不影響抗原抗體活性的熒光色素標記在抗體或抗原上，與其相應的抗原或抗體結合後，在熒光顯微鏡下進行觀察，從而確定抗原或抗體的性質和定位，包括直接法和間接法。
一、實驗步驟
1. 樣品準備（貼壁細胞、懸浮細胞以及組織等）
（1）對於貼壁細胞：
先將潔凈的蓋玻片在70%乙醇中進行浸泡處理，然後用幹凈無菌的鑷子放置到培養皿中，用無菌 PBS洗去殘留的乙醇。待細胞接近長成單層後取出蓋玻片，操作小心，防止細胞脫片。
（2）對於懸浮細胞：有2種方法，
①先在懸浮液中進行固定步驟，然後把細胞滴加在載玻片上，幹燥後細胞會緊貼在載玻片上。
②先在懸浮液中進行固定和染色步驟，離心洗脫，然後用移液管移至盒式玻片進行後續染色步驟。
（3）對於冷凍切片：切片放置在載玻片上後，可以直接進行固定等後續操作。
（4）對於石蠟切片：免疫熒光中石蠟切片較少，要先進行脫蠟和抗原修復處理。
2、 固定（防止離體組織自溶抗原擴散）
固定液包括：有機溶劑（甲醇、乙醇、丙酮等）；交聯劑（4%PFA、10%中性福爾馬林），固定液的選擇取決於被研究抗原的性質及所用抗體的特性，不過，目前甲醛用的還是最多的，但針對磷酸化的抗體，不適合用甲醛，會導致磷酸蛋白從膜表面轉移到胞漿中，故應選擇冰冷的無水甲醇或無水乙醇，同時應註意甲醛會揮發，在4-8°C不宜儲存太久。
固定時間：取決於組合塊的大小和類型，對於大多數組織，18-24h較為理想，細胞固定時間較短，一般2%的甲醛室溫固定20min即可。
以細胞樣品為例：用4%的多聚甲醛固定爬片15min， PBS浸洗玻片3次，每次3min。
3、通透（目的是使抗體進入胞內）
0.5%Triton X-100( 一種去垢劑，用PBS配制 )室溫通透20min（針對胞內抗原，若是細胞膜上表達的抗原則省略該步驟）；除瞭Triton X-100，丙酮也可作為通透劑，並且丙酮固定後的樣品不需要通透。
4、封閉（減少一抗和二抗與非特異位點進行結合）
通透後用PBS浸洗玻片3次，每次3 min，吸水紙吸幹PBS，在玻片上滴加山羊血清，室溫封閉30min。常用的封閉液包括：與二抗同一來源的血清、BSA或者是羊血清。從封閉開始所有的步驟，一定要註意樣品的保濕，避免樣品的幹燥，否則極易產生較高的背景。醛類固定的樣品，在用一抗孵育前用含0.3M甘氨酸的封閉液進行封閉。
5、一抗孵育
根據一抗的說明書，按照適當比例用一抗稀釋液稀釋一抗，用吸水紙吸盡封閉液，每張玻片滴加稀釋好的一抗並放入濕盒， 4℃孵育過夜。回收一抗，加入PBST， 在搖床上緩慢搖動洗滌5min，共洗滌3次
6、熒光二抗孵育
用吸水紙吸盡洗滌液後滴加稀釋好的熒光二抗，濕盒中孵育1h後，回收二抗，接著用PBST洗3次，每次5min；由於熒光容易淬滅，故從加熒光二抗起，後面所有操作步驟都要避光。
7、復染核（定位的關鍵）
在玻片上滴加DAPI，並註意避光孵育5min，對標本進行染核，然後用PBST洗3次，每次5min，洗去多餘的DAPI；
8、封片及熒光觀察：用吸水紙吸幹爬片上的液體，用含抗熒光淬滅劑的封片液封片，然後在熒光顯微鏡下觀察。
二、常見問題
1、弱熒光信號
| 可能問題 | 解決方法 |
| 錯誤的激發波長 | 確保激發波長與熒光基團激發光波長相匹配 |
| 不兼容的一抗或二抗 | 註意種屬問題 |
| 固定過度或不充分 | 適當調整時間 |
| 樣本保存不當 | 註意避光 |
| 一抗不好用 | 建議做陽性對照確認抗體的有效性 |
2、高背景
| 可能問題 | 解決方法 |
| 洗滌不足 | 充分洗滌，適當增加洗滌次數 |
| 樣本幹燥 | 在濕盒中孵育抗體，避免樣本幹燥 |
| 封閉不充分 | 延長時間或更換封閉液 |
| 抗體濃度過高 | 預實驗滴定，確認最佳濃度 |
| 二抗非特異性結合 | 不加一抗，隻加二抗，作對照 |
| 樣本自發熒光 | 提前檢測樣本自發熒光情況 |
3、細胞/組織形態被破壞
| 可能問題 | 解決方法 |
| 組織切片從玻片上脫落或切片有氣泡 | 適當增加固定時間 |
| 組織切片撕裂或有褶皺 | 切割刀片不太鋒利，考慮重新切片 |
| 細胞或組織固定不充分，自發裂解 | 適當增加固定時間，使用交聯性固定劑 |
三、註意事項：對照實驗的設置
1、 內源性組織背景對照：某些細胞和組織可能有固有的生物學性質，會產生背景熒光，對結果產生影響，例如色素脂褐質。因此在孵育一抗前，應對樣品進行觀察，確保抗原本身沒有信號。
2、陽性對照：用確認含有待測抗原的組織或細胞，與待測標本進行統一處理，結果應為陽性，可證明待測抗原有一定活性並且實驗過程中用的試劑及方法均可靠。
3、陰性對照：與陽性對照相反，用明確不含有待測抗原的細胞或組織切片染色，結果若為陰性，可排除染色過程中由於非特異性染色造成的假陽性結果。
IF 常見問題及優化方案
本文轉自小張聊科研及相關網絡內容整理