第一話：離心、過濾

第二話：親和層析

第三話：離子交換層析

第四話：病毒去除與滅活

引言

隨著細胞培養工藝灌流和連續流工藝革新和改進，抗體產量從每升幾百mg提高到5-10g甚至更高到50g/L以上，大規模抗體生產的“瓶頸”和生產成本逐漸從抗體表達轉移到瞭抗體純化，因此對提高純化通量和效率，降低成本的需求越來越大，成為抗體生產工藝研究的一個重點。

提高抗體純化效率一方面可以通過優化現有純化工藝設備、方法和工藝，挖掘現有純化技術的潛力。另一方面則可以通過開發創新性的介質和工藝，從根本上突破現有技術障礙。

概述

抗體分離純化的主要目的是將抗體與工藝相關雜質和產品相關雜質分離，最終獲得高純度、低潛在危害的抗體藥物。

純化過程中需要去除的工藝相關雜質包括細胞、細胞碎片、宿主細胞蛋白、宿主細胞核酸及培養基與加料液成分，需去除的產品相關雜質主要包括抗體片段和聚集體。純化過程還需具備足夠的病毒滅活去除能力，以去除宿主細胞自身表達的內源病毒樣顆粒和未及時發現的外源病毒。

大多數工藝利用ProteinA來捕獲抗體，並利用瞭至少1個離子交換層析作為精純步驟，僅少數工藝使用瞭疏水、羥基磷灰石和分子篩層析等步驟。

圖1中顯示瞭一個常見的抗體純化工藝。反應器收獲液首先經過離心和過濾，去除細胞和細胞碎片，然後經過ProteinA層析捕獲抗體,捕獲後的抗體經低pH孵育後，通過兩個離子交換層析進行精純,然後進行病毒過濾，最後換液並調整抗體濃度，得到抗體原液。

工藝中的低pH孵育和病毒過濾是兩個正交的專屬病毒去除滅活步驟。這兩個專屬步驟與層析步驟一起，可大大降低原液中可能存在的病毒數目。

圖1 抗體純化工藝流程

第一話 離心、過濾

抗體為胞外分泌型表達，純化的第一步是將培養液上清與細胞及細胞碎片分離開來。在實驗室規模，分離可通過簡單批次離心完成，但大規模抗體生產主要采用連續分離的方法，主要包括深層過濾、切向流過濾和連續流離心。

深層過濾的優點是簡單易用，前期投入低。深層過濾介質的孔徑分佈較廣，內表面積大，可依靠孔徑截留和內表面吸附雙重作用去除固體顆粒，比單一孔徑濾器能處理更大量的固體雜質，且流速更快。

深層過濾系統由一系列的濾器組成，介質的孔徑從上遊到下遊遞減（見圖2）。深層過濾本身不能達到無菌過濾，所以過濾系統的最後一級通常需要一個無菌濾器。深層過濾介質中含有矽藻土，矽藻土在抗體純化條件下帶正電荷，在去除細胞和細胞碎片的情況下，還可以去除部分帶負電荷的宿主細胞核酸和宿主細胞蛋白質，起到初步純化的作用。

深層過濾的缺陷是一次性濾芯使用費用高和處理量有限，在處理大體積培養液時需並聯多個濾器，費用和占地面積顯著增加，所以深層過濾的試用范圍限於100-2000L的中試規模的抗體純化。

圖2 深層過濾系統切面圖

切向流濾器在灌流反應器部分較為常用（見圖3），其高切向的流速可減少細胞在膜表面的沉積，從而可以處理大體積細胞培養液而不造成膜的堵塞。

切向流的流速越高，細胞沉積越少，但同時帶來的剪切力越高，細胞破碎風險越大。細胞破碎形成的細胞碎片更容易阻塞濾芯，並且細胞破碎釋放的胞內蛋白和核酸將大大增加後續純化步驟的壓力。

切向流濾器的使用以中空纖維最為普遍，其表面積大，又可以在孔腔內形成高剪切力。中空纖維濾器的工藝放大可通過增加纖維數目完成，簡單易行。

在切向流過濾工藝開發和優化方面，需要考慮的包括濾芯化學成分、濾芯表面積、孔徑、切向流流速、跨膜壓力。

切向流過濾存在死體積，可在過濾後期加人少量緩沖液，降低死體積中的抗體含量，減少抗體損失。切向流過濾處理量大，可用於超過10000L細胞培養的分離，達到每小時近5000L的液體處理量。其局限在於濾器費用較高，過濾時間較長，並且過濾速度的可控性低。

圖3 切向流濾器切面圖

連續流離心，尤其是采用碟片式離心機進行的連續流離心，是大規模抗體生產中主要采用的分離模式。

碟片式離心機腔體為錐形，細胞培養收獲液在靠近軸部加入，離心後上清液從軸部附近排出，細胞在離心力作用下，在錐形的底部邊線附近聚集結塊。

腔體定期在細胞聚集處輕微開啟，利用腔體內的壓力將細胞排出。細胞排出夾帶的液體損失可通過離心力（轉速）、腔體開啟頻率和開啟時間的優化，控制在5%以下。

連續流離心能夠去除絕大部分細胞和細胞碎片。殘留的少量細胞碎片可用深層過濾去除。碟片式離心機的優點是體積小，多層碟片形成的沉降面積大，液體處理量大，操作簡單、可靠，使用費用低。其缺點是前期設備投資髙，清洗較復雜，並缺少合適的小試模型。

連續流離心機與沉降器一樣利用細胞與培養基的密度差實現固液分離。圖4顯示的是一個商業化的碟片式連續流離心機。細胞培養液自離心機底部進料，在離心力的作用下，細胞在腔體的最外圍富集。

上下腔體周期性地短暫打開，釋放清除腔體內積累的細胞，這部分細胞返回反應器。細胞培養液上清自離心機頂端收獲。連續流離心分離速度快，液體處理量大，可實現高達3600L/d的灌流速度，細胞分離效果高於90%，有很好的應用前景。

連續流離心機的弱點是設備和操作相對復雜，機械和操作故障風險相對較高。同時離心時形成的細胞團有可能造成局部營養缺失或副產物積累，其程度和影響需進一步考察。連續流離心機在操作時還需考慮細胞的剪切力耐受性，避免細胞損傷。

圖4 連續流離心機切面圖

第二話：親和層析

親和層析是利用待分離組分和其特異性配體間具有特異性親和力，從而達到分離的目的。

原理：親和層析是基於生物分子與其它配基分子之間（如抗原與抗體，酶和底物，激素與受體，核酸中的互補鏈，多糖與蛋白復合體等）的親和吸附原理建立起來的。

蛋白質與層析載體上的配體通過共價鍵、范德華力、疏水力、靜電力等作用發生生物學專一性結合形成復合物，共價鏈接在載體表面的功能團配體上。蛋白質親和層析技術通過目標蛋白質與配體間通過特異性親和力吸附而達到分離純化的目的，具有生物專一性的特點，純化效率高。

ProteinA是金黃色葡萄球菌的一種膜蛋白，具有與抗體特異性結合的能力，ProteinA親和層析柱已成為應用廣泛的純化抗體的親和柱，可從腹水，血清和細胞培養上清或細胞抽提物中分離和純化多種哺乳動物不同亞型的抗體或包含抗體Fc片段的基因工程重組蛋白。

天然ProteinA由5個IgG結合域和其他未知功能的非Fc結合域組成，分子量42KD，天然ProteinA對IgG的親和能力很強，可以吸附大量IgG（見圖5）。但同時，天然ProteinA的其他非結合域和非目標蛋白結合，這樣被洗脫下來的蛋白純度不夠，會影響到後續的試驗。

運用基因工程技術，克隆出ProteinA的基因，並對其結構改造，除去瞭一些不重要的非結合域。偶聯這種重組RroteinA的瓊脂糖凝膠柱在蛋白純化中，的確提高瞭產物的純度。一般使用具備較少B結構域的ProteinA柱能獲得高純度的IgG，潔洗脫條件溫和，從而防止蛋白質集聚，保護蛋白活性。

圖5 ProteinA的結構示意圖

抗體純化的一個顯著特點是ProteinA親和層析的廣泛應用，超過2/3上市抗體品種的生產使用ProteinA進行抗體捕獲。ProteinA對抗體重鏈穩定區Fc有很高的特異性和親和力，對抗體純化有很好的通用性。

ProteinA對IgG的高親和能一步去除培養上清中大部分雜質，包括核酸、宿主細胞蛋白和可能存在的病毒，抗體純度達到95%或更高，收率近100%。ProteinA層析操作簡便，離心過濾後的細胞培養液可直接加載，不需經過任何處理。

抗體加載後，先用緩沖液淋洗，去除與介質或抗體弱結合的雜質，然後利用強酸性緩沖液（pH3.0-3.5）洗脫ProteinA上結合的抗體，再利用酸性更強的緩沖液（PH約2.0）去除強結合雜質，進行介質再生。ProteinA的清洗可以使用鹽酸胍、尿素或低濃度堿液。

ProteinA親和層析還是一個有效的抗體濃縮步驟，洗脫液中的抗體濃度可達10g/L以上，大大縮小後續精純的液體處理量。

ProteinA親和層析工藝開發和優化的重點是抗體載量、停留時間（流速）、淋洗和洗脫條件。Shukla等考察瞭14個IgG抗體的ProteinA純化，發現不同抗體間存在很大的差異，抗體的動態載量相差3倍（10-40g/L），洗脫需要的氫離子濃度相差一個數量級（pH3.0-4.1）。

利用相同的工藝，洗脫峰中宿主細胞蛋白濃度可以從接近完全清除到殘留21OOOppm，聚集體濃度可以從1%-20%，說明即使使用類似的平臺技術，也需對特定的抗體進行特定的工藝開發和優化。

ProteinA在使用過程中會發生脫落，脫落的主要原因是細胞培養液上清中含有蛋白水解酶，在上樣過程中會對ProteinA進行水解。部分脫落的ProteinA與抗體結合，殘留在洗脫液中。由於ProteinA具有免疫原性，需在下遊精純步驟中加以清除。

ProteinA雖然在抗體純化中被普遍接受，但改進和尋找ProteinA替代物仍是抗體純化研究的一個重點。

ProteinA在擁有高特異性、高親和力和高通用性等優點的同時，也具有若幹顯著缺點，包括費用高、載量低、線性流速有限、需低pH洗脫、ProteinA脫落等。

ProteinA親和介質比普通純化介質貴大約10倍，在抗體生產成本中所占的比重高於其他任何一個原材料。抗體在ProteinA上的載量較低，動態載量通常在20-30g/L，造成介質用量高，進一步提高瞭使用成本。為控制生產成本，ProteinA通常會重復使用。

實驗證明，利用較溫和的清洗步驟，ProteinA介質可以重復使用高達300次。為瞭降低介質成本，大規模抗體純化通常采用較小的ProteinA層析柱，將單批收獲液分成多批進行ProteinA純化，減小瞭純化通量。ProteinA上樣是親和純化的速度限制步驟。Ghose等建議，可利用雙重上樣流速縮短上樣時間。

在上樣初期，當抗體容易到達的結合位點為空時，采用高流速，等到抗體容易到達的位點被占領，抗體必須通過擴散達到孔內結合位點時，再采用低流速，給抗體更多的擴散時間，達到較高載量。

天然結構ProteinA在強堿清洗時會降解，所有隻能使用低濃度堿液（約0.lmol/LNaOH），尿素或鹽酸胍進行清洗，但尿素和鹽酸胍廢液處理困難，不適於大規模生產，而低濃度堿液在內毒素清除方面的能力有限。

MabSelectSuRe（GE）是一個改構的ProteinA，替換瞭ProteinA中易在堿性條件下降解（脫酰胺化）的天冬酰胺，從而使得重組ProteinA可以耐受強堿的清洗。

在改進ProteinA的同時，尋找和設計可以替代ProteinA的配體也是一個重要的研究方面。具備替代ProteinA潛力的配體包括多肽、適配子、化學合成配體等，但目前這些配體在結合力、特異性和通用性等方面還不能全方位達到ProteinA水平，離商業化應用尚有距離。在今後的5-10年裡，ProteinA還將是占主導位置的抗體捕獲介質。

第三話 離子交換層析

離子交換層析應用最為廣泛，目標物質和帶相反電荷的介質以靜電力的作用結合，然後在用高離子或改變pH的方式進行洗脫。

特別要註意，蛋白的pI表征的是蛋白表面的凈電荷，然而離子交換層析時是蛋白的局部電荷和介質作用，另外離子交換介質吸附的一類物質，如陽離子交換介質吸附帶正電荷的物質，所以在純化過程中，需要配合層析過程進來合理的結合及洗脫過程，才能達到預期的結果（原理見圖6）。

圖6 離子交換層析原理示意圖

陽離子交換是另一個較常用的抗體捕獲方法。至少有4個（Humira、Synagis、Soliris、Zenapax）在歐美上市的治療性抗體藥物采用瞭這種捕獲方法，另外多個處於臨床階段的抗體品種也采用瞭陽離子交換捕獲方法。

陽離子交換與ProteinA相比的最大優勢是成本。離子交換介質價格僅為ProteinA的1/10，可重復使用百次以上，並耐受強堿清洗。另外，陽離子交換介質的抗體載量可達100g/L，是ProteinA的2-5倍，可降低介質使用量。

Arunakumari等開發瞭一個基於陽離子交換抗體捕獲、陰離子交換精純的兩步抗體分離方法。在大大降低純化成本，縮短純化時間的同時，陽離子交換層析捕獲收率達到82%，捕獲後抗體純度超過97%，作者顯示此工藝可成功放大1000倍。

陽離子交換與ProteinA相比有兩個劣勢，一個是特異性差，另一個是通用性差，需針對不同抗體和抗體表達工藝進行優化，如不同抗體的等電點不同。即使是同一抗體，不同的翻譯後修飾也造成不同的等電點，這些都影響到陽離子交換緩沖液pH的選擇。

捕獲後的抗體需進一步去除宿主細胞蛋白、宿主細胞核酸、抗體聚集體、抗體片段和脫落ProteinA，以達到對患者安全的純度。精純一般采用兩步層析以保持足夠的純化冗餘，但采用一步精純的工藝也越來越多。

精純步驟常用的方法包括陰離子交換層析、陽離子交換層析、疏水作用層析、羥基磷灰石層析和分子篩，其中陰離子交換和疏水作用采用流穿模式，陽離子交換和羥基憐灰石采用結合-洗脫模式。各個層析步驟的主要雜質去除能力見表1。

兩步精純工藝一般會選擇一個流穿模式，一個結合-洗脫模式，而單一步驟精純一般會選擇流穿模式（因為捕獲步驟為結合-洗脫模式）。精純介質通常采用高效介質（直徑10-30um）以提髙分離的分辨率，同時提髙抗體的回收率。但采用小粒徑介質同時也限制瞭流速，延長瞭純化時間。

表1 層析步驟對雜質的清除作用

離子交換是最常見的精純步驟。經典的抗體純化步驟采用流穿的陰離子交換和結合-洗脫的陽離子交換兩步精純。陰離子交換對宿主細胞核酸和宿主細胞蛋白有很好的清除作用，而陽離子交換是去除多聚體和抗體片段的有效步驟。離子交換依靠抗體和雜質表面所帶電荷差異將其分離。

抗體的電荷來自多個組成部分。賴氨酸、精氨酸、組氨酸可帶負電荷，天冬氨酸、谷氨酸、半胱氨酸可帶正電荷，N-端的氨基可帶正電荷，C-端的竣基可帶負電荷，糖基化上唾液酸可帶負電荷。

抗體上的凈電荷取決於抗體的等電點和緩沖液的pH，當緩沖液pH低於等電點時，抗體帶正電荷；當pH高於等電點時，抗體帶負電荷。所以，通過調整緩沖液的pH，可以改變其在離子交換介質上的結合和流穿。需要指出的是，雖然一半以上氨基酸本身不帶電荷，但它們會通過結構影響抗體的表面電荷，也會影響鄰近酸性或堿性氨基酸的電荷。

陰離子和陽離子交換的區分在於介質上的活性基團，陰離子交換介質上的活性基團為陽性（帶正電荷），可吸附流動相中的陰性離子，陽離子交換介質上的活性基團為陰性（帶負電荷），可吸附流動相中的陽性離子。活性基團還可進一步分為強活性基團和弱活性基團，區分的標準是活性基團上所帶電荷是恒定的還是隨pH改變的。抗體純化使用的一般為強活性介質。

• 離子交換層析首先要平衡介質

在介質上加載相反電荷離子，主要是鈉離子或氯離子。平衡液選擇的標準是抗體（結合-洗脫模式）或雜質（流穿模式）易於取代平衡時加載的反荷離子吸附在介質上，但吸附又不能太強或不可逆，從而易於洗脫。

• 第二步是樣品的加載

樣品加載時的緩沖液為低鹽溶液，以促進抗體（結合-洗脫模式）或雜質（流穿模式）與反荷離子交換，在介質上的吸附。

• 第三步是淋洗

對於流穿模式，淋洗可采用平衡液，對於結合-流穿模式，淋洗可采用平衡液或可洗脫弱結合雜質的緩沖液，提高洗脫抗體純化。

結合-洗脫模式的第三步是洗脫，洗脫依靠的是增加流動相中的鹽濃度，增強反荷離子與抗體在介質上的競爭，從而洗脫介質上吸附的抗體和其他物質，洗脫下物質的順序是從弱結合組分到強結合組分。

通過優化洗脫條件，可增加抗體與雜質在洗脫峰中分離的分辨率，從而有效去除雜蛋白、聚集體、抗體片段等雜質。離子交換的最後一步是再生，利用高鹽緩沖液清除結合在介質上的所有物質，並在介質上重新加載反荷離子，準備下一個循環。

離子交換緩沖液中的緩沖體系應該在設定pH范圍提供足夠的緩沖能力，沒有毒性，並且與抗體和介質沒有相互作用。通常緩沖組分與介質應帶相同電荷，所以不會在介質上吸附。線性洗脫可提高洗脫的分辨率，但在大規模生產中，為保證操作的穩定性，一般采取階梯洗脫。

越來越多的公司開始使用一步精純來提高收率和純化速度，降低成本。Kelley等開發瞭一種一步精純的弱分離陰離子交換層析（WPC）方法。

弱分離陰離子交換層析操作條件介於流穿與結合-洗脫之間，采用比流穿操作更低的離子濃度，以提高流動相中的雜質與介質的結合能力，提高瞭本步驟的雜質去除能力。低離子濃度同時也增加瞭抗體在介質上的吸附，造成部分抗體吸附在介質上（大部分抗體流穿）。

這部分弱吸附上抗體可以通過一個短暫的淋洗洗脫，保證抗體收率。Kelley等顯示，ProteinA捕獲和弱分離陰離子交換組成的兩步抗體純化工藝可滿足抗體在宿主細胞蛋白、ProteinA、內毒素和宿主核酸的清除要求。聚集體的清除較為復雜一些。

對於部分抗體品種，聚集體比單體的吸附能力強，聚集體可以采取WPC方法去除，但對另外一些抗體品種，單體比聚集體與陰離子交換介質的吸附能力更強，這樣品種就隻能通過篩選陰離子交換介質或采用結合-洗脫陰離子交換方式去除聚集體。

在上一節介紹到，Arunakumari等在陽離子交換抗體捕獲的基礎上，采用一步陰離子交換精純的兩步抗體分離方法，可將宿主細胞蛋白和核酸降低到足夠低的水平。

抗體純化技術的另一個進展是膜層析技術日益廣泛的應用，尤其是在陰離子膜層析方面。陰離子交換層析膜與填料層析介質使用的是同樣的活性基團，但膜層析具有如下幾個顯著優勢。

一是速度快，膜層析通過對流方式，使雜質能夠直接接觸到膜上所有的結合位點，開放式模孔結構利用分子擴散，可同時保證高流速和高載量。

二是載量高，膜層析動態載量可高達l-10kg/L膜體積是填料層析的10-100倍。三是體積小，緩沖液用量降低。膜層析回收率可達95%-100%，在宿主細胞蛋白去除、核酸去除及病毒去除能力方面也與填料層析類似，具備替代傳統填料層析的優勢。膜層析為一次性使用，在成本上比循環使用的填料高。

講一講：疏水層析

疏水層析和反相層析分離物質的依據是一致的，利用疏水介質的疏水性配基與流動相中的一些疏水分子發生可逆性結合而進行分離。

該方法基於的是蛋白質的疏水差異，在高鹽溶液中，蛋白質會與疏水配基相結合，而其他的雜蛋白則沒有此種性質，利用此種性質，可以將蛋白質初步的分離，用於鹽析之後的蛋白質進一步提純。

蛋白質的疏水性強弱取決於其表面疏基團的分佈，同時與樣品緩沖液的離子強度，離子種類，pH，所處的溫度都有一定的關系，在進行疏水層析時要保持恒定的溫度，且要對樣品緩沖液的離子種類及離子強度，pH進行篩選對比分析。

第四話 病毒去除與滅活

抗體生產常用的CHO和NS0細胞系都分泌內源逆轉錄病毒樣顆粒。這些顆粒不具備感染能力，但為瞭安全，需加以清除。

在細胞培養中，環境或原材料中夾雜的外源病毒有可能感染並利用細胞大量復制。外源病毒感染有可能通過在線或離線檢測發現，及時終止生產，阻斷傳播。但病毒感染也有可能不能及時發現，造成病毒隨抗體藥物進人下遊環節。

需要指出的是，雖然存在這種間接感染的可能性，到目前為止還沒有發現任何通過使用抗體藥物感染病毒的案例。

控制病毒風險需要從三方面入手：

• 控制原材料和工藝，減少病毒污染；
• 利用原材料和中間產品檢測及時發現污染；三是在純化步驟中建立足夠的病毒滅活去除能力，清除未發現的病毒。

抗體純化中的各層析步驟都有不同程度的病毒滅活去除能力，尤其是陰離子交換。在陰離子交換中性上樣條件下，病毒帶負電荷，會吸附在陰離子交換介質上，而抗體則帶正電荷流穿。蛋白A親和層析和深層過濾也有很強的病毒去除能力。

Zhou等發現，常用的深層過濾器對4種測試的模型病毒都有顯著的去除作用，其中對鼠細小病毒的去除能力超過4Log1010。在純化步驟本身的病毒去除能力基礎上，抗體純化還包括兩個正交的專屬病毒滅活去除步驟，即低pH孵育和病毒過濾。

病毒種類繁多，對病毒去除滅活的敏感度不同，需使用具有廣泛代表性的病毒作為模型病毒加以研究和驗證。Miesegaes等分析瞭提交到美國FDA的抗體藥物申報材料，發現逆轉錄病毒、細小病毒和皰疹病毒是病毒去除滅活驗證最常使用的模型病毒。

3種病毒中的逆轉錄病毒和皰疼病毒為包膜病毒，體積大，理化抗性低。細小病毒則是無包膜病毒，體積小，理化抗性高。逆轉錄病毒中又以鼠白血病病毒最為常用，細小病毒中又以鼠細小病毒最為常用。采用鼠白血病病毒的原因是用於模擬宿主細胞自身表達的內源性逆轉錄病毒樣顆粒。鼠細小病毒可以感染抗體生產用的主要宿主細胞，且體積小、理化抗性高，用來模擬難以去除的外源病毒。

ICHQ5A要求至少使用三種病毒進行病毒去除驗證；而實際上一般會采用四種病毒進行病毒去除驗證。MVM、MuLv、PRV以及Reo-3是目前CHO體系病毒去除驗證較為使用較多的病毒（見表2）。

表2 CHO體系病毒去除種類要求

Miesegaes等的總結數據顯示，對於逆轉錄病毒和皰疹病毒，蛋白A親和、陽離子交換、陰離子交換、低pH孵育、50nm病毒過濾和20mn病毒過濾等純化步驟都有較好的去除或滅活能力。

除陽離子交換層析清除逆轉錄病毒效率稍低（>3Log10）外，其他各步驟的平均清除能力都超過4Log10。對於體積小、理化抗性高的細小病毒，低pH孵育、蛋白A層析、陽離子層析則沒有顯著的去除滅活效果，僅陰離子交換和20nm病毒過濾的去除能力超過4Log10。

低pH孵育是專屬的病毒滅活步驟，對包膜病毒有極強的滅活作用。低pH造成病毒包膜上的蛋白結構、膜結構、衣殼結構變化，從而去除病毒的傳染能力。低pH孵育步驟可以方便地置於ProteinA層析後，在低pH洗脫液的基礎上，調整pH，進行0.5-2小時的孵育。

Brorson等系統研究瞭pH、時間、溫度、抗體濃度，緩沖液滲透壓，宿主細胞雜質，抗體聚集在低pH孵育中對鼠白血病病毒的滅活作用，發現在很寬的操作條件下，低pH孵育能可靠地實現超過4-6Log10的滴度（見圖7）。

需要指出的是，低pH對抗體有多種不利影響，包括促進抗體聚集、斷裂、加速脫酰胺化等，所有在確定孵育pH、孵育時間等參數上，需要平衡考慮對病毒滅活和抗體質量的影響。

低pH孵育完成後，利用Tris等弱堿溶液進行中和。在中和過程中常會伴有沉淀產生，這些沉淀主要是宿主細胞蛋白和核酸等雜質，可通過深層過濾去除。增大細胞分離步驟使用的深層過濾面積可以減輕pH中和步驟沉淀產生。低pH孵育對鼠細小病毒等無包膜病毒沒有明顯的滅活效果。

圖7 低pH孵育滅活病毒動力學曲線圖

國內IND申報時，一般選擇低pH和膜過濾這兩個工藝。國外進行申報時，除瞭選擇低pH和膜過濾，還需進行層析工藝。

層析法最常用的是親和層析和離子交換層析。層析法是目前常用的樣品不同組分分離技術，利用各組分與固定相親和力的差異或相互作用不同的原理，實現病毒與樣品分離的目的。國內的指導原則雖然沒有硬性的規定，但通常需要做三個批次。

在國外的指導原則中，明確指出至少分別做兩次獨立的研究來證實清除的可重復性，因此一般是一批樣品重復兩次（見表3）。

表3 國內外申報資料病毒去除和滅活的比較

病毒過濾是另一個專屬的病毒去除步驟，通過納米級的孔徑截獲抗體中的病毒。病毒過濾受工藝本身變化的影響很小，是可靠的病毒去除步驟。

在抗體純化工藝中，小孔徑（去除20mn及以上病毒的細小病毒）濾器的應用遠遠超過大孔徑（去除50mn及以上的逆轉錄病毒）濾器。這主要是因為低pH孵育對細小病毒無去除滅活作用，需要20mn濾器作為有效的小粒徑病毒去除步驟。

Miesegaes等的總結說明，50mn濾器的鼠細小病毒的平均去除效果在2Log10左右，而20nm濾芯的去除能力能達到4Log10以上。

病毒過濾主要采用死端過濾。死端過濾操作簡單，而切向流過濾在操作復雜的同時，其剪切力有可能造成抗體聚集。病毒過濾濾器價格昂貴，單位膜面積價格是無菌濾器的10倍，所以在工藝優化中需提高單位面積通量，以降低生產成本。

病毒過濾通常置於純化完成之後，減輕雜質對濾膜的阻塞。盡管如此，病毒過濾前需要使用0.2um或0.1um的無菌濾器或深層過濾濾器進行預過濾，進一步去除宿主細胞雜質和抗體聚集體。

死端病毒過濾使用空氣在上遊儲罐保持固定壓力，壓力越高，單位體積的過濾速度和載量越高，但壓力不應高於濾芯建議的使用壓力。

在過濾過程中，過濾速度會逐漸衰減，衰減速度直接影響到過濾的載量。抗體濃度對過濾有直接影響，濃度增加，過濾速度降低。濃度降低，需要濾過的液體體積增加。具體最佳的抗體濃度，需要針對性地通過實驗確定。

講一講：超濾換液

超濾膜系統是以超濾膜絲為過濾介質，膜兩側的壓力差為驅動力的溶液分離裝置。超濾膜隻允許溶液中的溶劑（如水分子）、無機鹽及小分子有機物透過，而將溶液中的懸浮物、膠體、蛋白質和微生物等大分子物質截留，從而達到凈化和分離的目的。

超濾在治療性蛋白以及試劑蛋白的純化過程中是比較關鍵的步驟，用於替換緩沖液和濃縮。小規模的時候，水和小分子可以通過離心或壓力的方式透過半透膜，蛋白濃度在膜表面濃度會變得很高，在抗體超濾過程中，尤其在低溫過程超濾時，易出現渾濁現象，而加入精氨酸可以降低聚體的形成。

治療性抗體由於需要高劑量，因此需要超濾至高濃度，高蛋白濃度會形成高粘度，而且需要更合適的處方，然而超濾過程中形成高蛋白濃度與小的親水半徑有關，甚至是2nm，在proteinA層析低pH洗脫的時候也出現小的水合半徑，隻有溶菌酶的10倍小。這主要是由於處於低鹽或pH下，靜電作用不能完全被隔離，而在高蛋白濃度下，過量的體積占主要作用。

綜合以上所述

純化的整個層析過程：

1、平衡

使層析柱處於可使用的狀態，用於維護良好的結合條件並定義色譜曲線的基線零點。

2、上樣

目標分子與介質能夠充分，均勻有限接觸，實現結合的過程。上樣量，上樣流速等對分離過程都有很大影響，需要實驗摸索最佳上樣過程。

3、洗雜

將介質表面，孔內，間隙殘留的未和介質結合的物質洗掉。

4、洗脫

將結合在介質上（包括孔內和表面）的物質逐步洗脫下來，洗脫過程又可分多步進行，把結合強弱不同的物質分開，實現分離的目的。

5、維護

維護包括再生，清洗，消毒，保存。

另外抗體純化的主要任務為：

1、工藝優化

親和工藝、精純工藝、除病毒滅活與過濾工藝；

2、小試純化

用於藥理、毒理、穩定性等研究提供樣品；

3、工藝放大及中試生產將優化後的工藝進行規模放大，使其適用於200L工藝，同時生產出用於臨床申報的產品；

4、文件書寫

用於臨床申報及工藝轉移的文件。