基礎實驗技能——PCR擴增

天下有雪 2024-05-11 02:12 1次浏览 0 条评论 taohigo.com

1985年,美國PE2cetus公司人類遺傳研究室的Mullis等人發明瞭體外無限擴增核酸片段的聚合酶鏈式反應,即PCR技術。目前,PCR技術已在眾多的研究領域得到廣泛應用,如在基因克隆,基因定點突變,c DNA文庫構建,基因測序,載體構建以及人類基因組計劃等方面發揮著重要作用。

一、原理介紹

聚合酶鏈式反應(PCR)是一種用於擴增特定的DNA片段的分子生物學技術,它可看作是生物體外的特殊DNA復制,特點是能將微量的DNA大幅增加。原理類似於DNA的天然復制過程,其特異性依賴於與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。聚合酶鏈式反應由變性—退火—延伸三個基本反應步驟構成:①模板DNA的變性:模板DNA經95℃高溫時變性成單鏈;②模板DNA與引物的退火:模板DNA經加熱變性成單鏈後,溫度降至55-60℃時,引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合;③引物的延伸:當溫度調至72℃時、DNA模板-引物結合物在DNA聚合酶的作用下,以dNTP為反應原料,靶序列為模板,按堿基互補配對與半保留復制原理,合成一條新的與模板DNA鏈互補的半保留復制鏈,重復循環三個過程就可獲得更多的復制鏈,而且這種新鏈又可成為下次循環的模板。每完成一個循環需3分鐘左右,2小時左右就能將目的基因擴增放大幾百萬拷貝。

二、實驗步驟

1. 準備材料和試劑

滅菌的200ul 離心管、依次加入5 μl Taq緩沖液(10×),5 μl dNTP,2.5 μl引物1(10pmol/ μl),2.5 μl引物2(10pmol/μl),1~10 ng模板DNA,無菌水水補至50 μl。

2. 混勻以上溶液放置 PCR 擴增儀中。

3. 設置PCR循環參數,一般為:

變性 94 ℃30~40s,退火55 ℃ 1min ,延伸72 ℃1.5~2min,循環次數為30~35次,反應結束10℃保存。

4. 瓊脂糖凝膠電泳,反應結束後,取1/5體積的反應液進行0.8%~2%電泳,檢測目的片段。

PCR 產物特異性差,是由於 模板DNA 的復雜度不同,PCR的結果會有些差異。如用核 DNA 作模板即可能產生多條帶擴增。這時也可采用一些方法將非特異性產物減至最少。一般可提高退火溫度,必要時退火溫度升至 65 ℃ ,引物延伸溫度降至 65 ℃ ,使三溫度變化 PCR 變成兩溫度變化 PCR。也可減少引物量,或者減少體系Taq DNA聚合酶含量,還可減少退火和引物延伸的時間,以解決非特異性的擴增。此外,如果改變瞭Taq 緩沖液中Mg2+濃度(一般降低Mg2+濃度),也可有助於提高 PCR 擴增的特異性。

5. PCR體系分析:

由靶序列模板、耐熱DNA聚合酶、脫氧核苷酸三磷酸鹽(dNTPs)、正反向引物、反應緩沖液、二價陽離子等組成。很多公司銷售PCR Mix,即除模板和引物外,其他所需成分均已混合優化至最佳配比,廣泛適用於各種模板、引物。

1)模板

模板可以是單鏈或雙鏈DNA等。如果模板是mRNA,需反轉錄得到cDNA,以cDNA為模板進行PCR擴增。常用的模板:①基因組DNA。試劑盒提取細胞基因組DNA可以直接使用,無需純化。②粗提DNA。應避免混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制藥及能結合DNA的蛋白質。③純化的DNA,由於去除瞭抑制PCR反應的雜質,可提高擴增成功率。

PCR 反應所需DNA模板的量極微,依DNA的性質而定,不到 1 μg 的基因組DNA序列,就足以進行PCR分析;對於質粒克隆的DNA,一般用納克(ng)量;對於染色體DNA,一般要到微克(μg)級。PCR甚至可以從1個DNA分子擴增特定的DNA序列。對不同實驗的具體用量,可以通過實驗具體確定。

常規PCR mix的推薦模板量

類型 哺乳動物基因組DNA(1 μg含有3×105 個DNA分子) 大腸桿菌基因組DNA(1 μg含有2×108 個DNA分子) 質粒 cDNA
模板量 管傢基因等高拷貝基因10 ng即可,復雜模板10 ng~500 ng。 100pg~1ng ~1pg 取決於目的序列拷貝數。通常建議cDNA模板稀釋10~100倍再PCR

2)引物

引物是影響擴增效率和擴增特異性的關鍵因素,引物好壞也直接影響擴增是否成功。引物設計有兩個主要考慮因素:特異性和擴增效率。特異性是由錯配的頻率決定的,特異性差的引物易產生錯誤的擴增產物。擴增效率是指引物以每循環增加兩倍擴增產物達到理論最優的能力。

引物設計的一般原則:

引物長度 引物的最佳長度為24或25個堿基左右。但是如果需要調整Tm值,引物的長度可以控制在21至28個堿基之間。當擴增≥10 kb長片段時,25~35個堿基之間的引物可以提供更好的結果。引物過短,會降低產物的特異性,每增加一個核苷酸,引物特異性可以提高 4 倍。引物過長,會使退火過程不完全,與模板結合不充分,以至引起擴增產物的明顯減少。
引物末端 引物3’端最後一個堿基最好為G或者C;引物 3’端應避免出現發夾結構。
引物G+C含量 引物的GC含量控制在40%-60%之間。
Tm值 引物額外附加序列,即與模板非互配對序列,不應參與引物 Tm 的值計算;正向引物和反向引物的Tm值相差不超過5℃為佳,Tm值調整至55℃~65℃為佳。
堿基的分佈 引物 A、G、C、T整體分佈要盡量均勻,避免使用GC或者AT含量高的區域;避免連續出現4個及以上的相同堿基,或者某兩個核苷酸連續重復出現(例如,ACCCC或ATATATAT;引物內部或者兩條引物之間避免有5個堿基以上的互補序列;兩條引物的 3’端避免有3個堿基以上的互補序列。
序列特異性 引物設計完畢請使用 NCBI BLAST功能檢索引物特異性,以避免非特異性擴增產生。註意: PCR的產量通常取決於PCR引物的3’端,引物間形成二聚體會降低擴增效率。

引物合成與保存:設計好序列交由公司合成,OPC或PAGE純化,以減少非特異擴增和信號強度的降低,凍幹引物於-20 ℃可以保存12~24個月,甚至更長;液體狀態引物於-20 ℃可以保存6個月左右。一般用無菌水將引物配成高濃度的儲備液(如100 μmol/L)。

引物濃度:一般在0.2~1 μmol/L范圍內,濃度偏高會導致非特異性產物堆積和錯配,同時能增加引物之間形成引物二聚體的概率,非特異性產物和引物二聚體與產物競爭使用酶、dNTPs和引物,結果導致目的產物產量降低。商業合成的引物一般以OD值計算,其有關量值可用以下近似方法計算:引物中每個脫氧核苷酸堿基的平均分子量近似為324.5,則一條20個堿基的引物分子量為20×324.5=6490,而1OD相當於 30 μg 的引物。如果得到一管5OD的 25 mol/L 的引物,其質量數為5 × 30=150 μg/L,摩爾數=150/6490= 23 nmol/L,若加去離子水 400 μl 溶解,則濃度為23 nmol/400 ul=57 μl/L 。

3)dNTP

工作濃度為20~200 μmol,四種 dNTPs 應當等量。如 dNTPs 濃度過高,則加快反應速度,造成非靶位置啟動和延伸時核苷酸的錯誤摻入以及增加室驗成本,而且當 dNTP 濃度高於50 mmol/L時,還會抑制 Taq 酶的活性,如 dNTPs 過低,反應速度下降,但可提高實驗的精確性。在具體操作中,需根據實驗具體情況,確定最適的 dNTPs 的濃度。在標記探針及測序等特殊 PCR中,其中的某一種脫氧核苷酸還可被標記核苷酸所替代。dNTPs可與 Mg2+ 結合,應註意 Mg2+ 濃度與 dNTPs 濃度之間的關系,Mg2+濃度比 dNTPs 濃度高0.2~2.5 mmol/L。

4)緩沖液

反應緩沖液需含有Tris、KC1、MgCl2、牛血清白蛋白等。10~50 mmol/L Tris-CI (pH 8.4):作用是維持 Taq 酶作用環境的偏堿性。25~50 mmol/L KCI:作用是促進引物退火,濃度高於50mmol會抑制Taq酶的活性。1.5~2.0 mmol/L MgCl2:Taq酶具有Mg2+依賴性,Mg2+濃度會顯著影響反應的特異性和擴增片段的產量,過量能增加非特異擴增並影響產率,過低則酶活性顯著下降。100 μg/ml 牛血清白蛋白(BSA):對酶有一定的保護性,如質量不好將起相反的作用,建議使用乙酰化的BSA。明膠、Tween-20、二硫蘇糖醇(DTT)也有類似作用。

參考文獻:PCR技術在DNA片段擴增的應用與意義