1985年，美國PE2cetus公司人類遺傳研究室的Mullis等人發明瞭體外無限擴增核酸片段的聚合酶鏈式反應，即PCR技術。目前，PCR技術已在眾多的研究領域得到廣泛應用，如在基因克隆，基因定點突變，c DNA文庫構建，基因測序，載體構建以及人類基因組計劃等方面發揮著重要作用。

一、原理介紹

聚合酶鏈式反應（PCR）是一種用於擴增特定的DNA片段的分子生物學技術，它可看作是生物體外的特殊DNA復制，特點是能將微量的DNA大幅增加。原理類似於DNA的天然復制過程，其特異性依賴於與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。聚合酶鏈式反應由變性—退火—延伸三個基本反應步驟構成：①模板DNA的變性：模板DNA經95℃高溫時變性成單鏈；②模板DNA與引物的退火：模板DNA經加熱變性成單鏈後，溫度降至55-60℃時，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合；③引物的延伸：當溫度調至72℃時、DNA模板-引物結合物在DNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應原料，靶序列為模板，按堿基互補配對與半保留復制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補的半保留復制鏈，重復循環三個過程就可獲得更多的復制鏈，而且這種新鏈又可成為下次循環的模板。每完成一個循環需3分鐘左右，2小時左右就能將目的基因擴增放大幾百萬拷貝。

二、實驗步驟

1. 準備材料和試劑

滅菌的200ul 離心管、依次加入5 μl Taq緩沖液（10×），5 μl dNTP，2.5 μl引物1（10pmol/ μl），2.5 μl引物2（10pmol/μl），1~10 ng模板DNA，無菌水水補至50 μl。

2. 混勻以上溶液放置 PCR 擴增儀中。

3. 設置PCR循環參數，一般為：

變性 94 ℃30~40s，退火55 ℃ 1min ，延伸72 ℃1.5~2min，循環次數為30~35次，反應結束10℃保存。

4. 瓊脂糖凝膠電泳，反應結束後，取1/5體積的反應液進行0.8%~2%電泳，檢測目的片段。

PCR 產物特異性差，是由於 模板DNA 的復雜度不同，PCR的結果會有些差異。如用核 DNA 作模板即可能產生多條帶擴增。這時也可采用一些方法將非特異性產物減至最少。一般可提高退火溫度，必要時退火溫度升至 65 ℃ ，引物延伸溫度降至 65 ℃ ，使三溫度變化 PCR 變成兩溫度變化 PCR。也可減少引物量，或者減少體系Taq DNA聚合酶含量，還可減少退火和引物延伸的時間，以解決非特異性的擴增。此外，如果改變瞭Taq 緩沖液中Mg2+濃度（一般降低Mg2+濃度），也可有助於提高 PCR 擴增的特異性。

5. PCR體系分析：

由靶序列模板、耐熱DNA聚合酶、脫氧核苷酸三磷酸鹽（dNTPs）、正反向引物、反應緩沖液、二價陽離子等組成。很多公司銷售PCR Mix，即除模板和引物外，其他所需成分均已混合優化至最佳配比，廣泛適用於各種模板、引物。

1）模板

模板可以是單鏈或雙鏈DNA等。如果模板是mRNA，需反轉錄得到cDNA，以cDNA為模板進行PCR擴增。常用的模板：①基因組DNA。試劑盒提取細胞基因組DNA可以直接使用，無需純化。②粗提DNA。應避免混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制藥及能結合DNA的蛋白質。③純化的DNA，由於去除瞭抑制PCR反應的雜質，可提高擴增成功率。

PCR 反應所需DNA模板的量極微，依DNA的性質而定，不到 1 μg 的基因組DNA序列，就足以進行PCR分析；對於質粒克隆的DNA，一般用納克（ng）量；對於染色體DNA，一般要到微克（μg）級。PCR甚至可以從1個DNA分子擴增特定的DNA序列。對不同實驗的具體用量，可以通過實驗具體確定。

常規PCR mix的推薦模板量

2）引物

引物是影響擴增效率和擴增特異性的關鍵因素，引物好壞也直接影響擴增是否成功。引物設計有兩個主要考慮因素：特異性和擴增效率。特異性是由錯配的頻率決定的，特異性差的引物易產生錯誤的擴增產物。擴增效率是指引物以每循環增加兩倍擴增產物達到理論最優的能力。

引物設計的一般原則：

引物合成與保存：設計好序列交由公司合成，OPC或PAGE純化，以減少非特異擴增和信號強度的降低，凍幹引物於-20 ℃可以保存12~24個月，甚至更長；液體狀態引物於-20 ℃可以保存6個月左右。一般用無菌水將引物配成高濃度的儲備液（如100 μmol/L）。

引物濃度：一般在0.2~1 μmol/L范圍內，濃度偏高會導致非特異性產物堆積和錯配，同時能增加引物之間形成引物二聚體的概率，非特異性產物和引物二聚體與產物競爭使用酶、dNTPs和引物，結果導致目的產物產量降低。商業合成的引物一般以OD值計算，其有關量值可用以下近似方法計算：引物中每個脫氧核苷酸堿基的平均分子量近似為324.5，則一條20個堿基的引物分子量為20×324.5=6490，而1OD相當於 30 μg 的引物。如果得到一管5OD的 25 mol/L 的引物，其質量數為5 × 30=150 μg/L，摩爾數=150/6490= 23 nmol/L，若加去離子水 400 μl 溶解，則濃度為23 nmol/400 ul=57 μl/L 。

3）dNTP

工作濃度為20~200 μmol，四種 dNTPs 應當等量。如 dNTPs 濃度過高，則加快反應速度，造成非靶位置啟動和延伸時核苷酸的錯誤摻入以及增加室驗成本，而且當 dNTP 濃度高於50 mmol/L時，還會抑制 Taq 酶的活性，如 dNTPs 過低，反應速度下降，但可提高實驗的精確性。在具體操作中，需根據實驗具體情況，確定最適的 dNTPs 的濃度。在標記探針及測序等特殊 PCR中，其中的某一種脫氧核苷酸還可被標記核苷酸所替代。dNTPs可與 Mg2+ 結合，應註意 Mg2+ 濃度與 dNTPs 濃度之間的關系，Mg2+濃度比 dNTPs 濃度高0.2~2.5 mmol/L。

4）緩沖液

反應緩沖液需含有Tris、KC1、MgCl2、牛血清白蛋白等。10~50 mmol/L Tris-CI （pH 8.4）：作用是維持 Taq 酶作用環境的偏堿性。25~50 mmol/L KCI：作用是促進引物退火，濃度高於50mmol會抑制Taq酶的活性。1.5~2.0 mmol/L MgCl2：Taq酶具有Mg2+依賴性，Mg2+濃度會顯著影響反應的特異性和擴增片段的產量，過量能增加非特異擴增並影響產率，過低則酶活性顯著下降。100 μg/ml 牛血清白蛋白（BSA）：對酶有一定的保護性，如質量不好將起相反的作用，建議使用乙酰化的BSA。明膠、Tween-20、二硫蘇糖醇（DTT）也有類似作用。

參考文獻：PCR技術在DNA片段擴增的應用與意義