前言
提起“克隆”、“載體構建”這兩個詞，似乎總會同時提到“限制性內切酶”。沒錯，在過去數十年，用限制性內切酶產生黏性末端，並通過堿基互補配對，連接兩個甚至更多片段的克隆方法，是載體構建的經典方案。
近年來，“無縫克隆”逐漸受到科學傢的歡迎。相比之下，無縫克隆操作更加簡單，靈活性更強，同時幾乎不受序列的限制，一次可定向組裝高達10個片段的dsDNA。這篇文章將帶大傢認識無縫克隆的原理、優勢和應用。
一、無縫克隆的原理
首先要強調的是，無縫克隆有兩個主要的流派：Gibson assembly和Golden
Gate assembly。由於Golden Gate assembly依賴於Type
IIS限制性DNA內切酶（如BsaI，BbsI等），一旦載體不攜帶相應的識別序列，這種方法就走不通瞭。而假設通過PCR引入Type IIS內切酶識別序列，那便不是真正意義上的“無縫”瞭。因此本文所提的“無縫克隆”，特指Gibson assembly流，不涉及任何Golden
Gate及其他流派。
目前，無縫克隆比較著名的商品化名字有NEB傢的Gibson Assembly和NEBuilder HiFi DNA Assembly，Clontech傢的In-Fusion，以及Invitrogen傢的GeneArt等。但無論叫什麼名字，其基本原理都和早期的Gibson assembly的是一樣的。
與傳統的雙酶切克隆一般，無縫克隆同樣需要依賴於dsDNA的黏性末端進行互補配對，並利用DNA連接酶催化形成磷酸二酯鍵修復缺口（nick）。但是，無縫克隆並不使用“內切酶”來制造黏性末端，而是通過“外切酶”來產生的。
（Tips
1：“內切酶”是在核酸鏈內部進行“一刀兩斷”剪切的酶，而“外切酶”是在核酸鏈的末端、即外部進行“逐個堿基”剪切的酶）
在無縫克隆中使用的外切酶是T5核酸外切酶，它能沿著5’→3’方向，降解dsDNA，從而產生黏性末端。
（Tips
2：T5外切酶同時具有ssDNA外切酶活性，但並不降解超螺旋dsDNA。）
讀到這裡大傢應該能想到，假設要拼接的兩個片段的末端，是一模一樣的堿基序列，那麼通過T5外切酶，就能產生幾乎一致的黏性末端瞭。沒錯，無縫克隆的原理便是如此。如下圖所示，假如我們需要將3個片段按照1→2→3的順序拼接起來，隻需要保證1的末尾和2的開頭，以及2的末尾和3的開頭，具有同樣的序列即可（我們可稱之為同源臂）。這個同源臂序列，並不是額外添加進去的，而是載體或者拼接片段本身攜帶的。也就是說，我們可以通過PCR的方法，在外源拼接片段的兩端加上線性化載體的序列即可。
但是，T5外切酶並不能保證將每一個片段的5’末端都降解成一樣長的黏性末端，退火之後，極可能存在缺失的堿基。這時候，就需要借助DNA聚合酶，也就是我們平時用於PCR擴增的酶進行修復。最後一步，便是借助Taq DNA連接酶，催化形成磷酸二酯鍵，將所有缺口補齊。
有心的讀者會發現，假設T5外切酶一直降解dsDNA的5’末端，豈不是最終會將其變成ssDNA？這樣如何進行下遊的拼接？難道僅僅依靠DNA聚合酶的5’→3’合成雙鏈的反應與之競爭？
無縫克隆的另一高明之處，就是利用高溫。T5外切酶的最適溫度是37℃，然而無縫克隆是在50℃下進行的，加之添加的酶單位較少，因此整個反應體系很快便會失去外切的活性，而DNA聚合酶的活性得以維持。而為瞭保證DNA連接反應順利進行，無縫克隆采用的是熱穩定的Taq
DNA連接酶，而非傳統的T4 DNA連接酶。同時，為瞭保證黏性末端能夠在50℃下進行互補配對，同源臂的長度一般>15 bp。
二、無縫克隆的優勢
不受片段序列的限制、實現任意組裝，是無縫克隆的最大優勢。
傳統的酶切克隆，需要克隆載體的多克隆位點攜帶可用的單一酶切位點。假如這些酶切位點在外源片段之中同時存在，克隆就會受到限制。而無縫克隆不依賴於限制性內切酶，僅靠同源臂進行互補配對。因此每次進行片段拼接時，僅需通過引物制作同源臂，而不需要像以往一般仔細地檢查PCR出來的外源片段內部是否同時會被內切酶消化。與此同時，我們也不再需要購買各式各樣的內切酶，隻要一個試劑盒就可解決所有克隆實驗。
無縫克隆第二個優點是可以同時無縫地拼接多個片段。傳統的酶切克隆，由於酶切位點有限，我們能組裝的片段數量是有限的。同時，由於酶切位點之間存在著一定的空間距離，片段與片段之間不可避免地會產生間隔，或者說“縫隙”。此外，酶切克隆通常一次隻能拼接2-3個片段。隨著拼接片段的增多，傳統方案的效率會急劇降低，通常隻能分多次拼接。
（Tips
3：過去有一種提高酶切連接多片段的方法，是在連接後，在載體和外源片段的邊界上設計引物，進行一輪PCR，擴出全長連接產物，跑膠純化後再進行二次連接。然而這種方法耗時耗力，且長片段的PCR容易突變或失敗，同時PCR的引物還引入瞭更多的無意義序列。）
而無縫克隆可輕松拼接4-5個片段，最高可達10個，而且隻需要將所有片段混在一個管子裡，進行一步反應。
節省時間，是無縫克隆的第三個優勢。傳統的酶切克隆，首先需要進行PCR，膠回收，然後酶切載體和外源片段，再過柱純化，隨後連接，最後轉化。而如果需要進行多片段組裝，部分步驟還需重復幾輪。每多一個片段，可能要多花費三天到一周的實驗時間。而無縫克隆僅需PCR和膠回收，隨後即可直接進行多片段拼接。拼接10個片段所花的時間，跟拼接2個片段的幾乎是一樣短的。
三、應用舉例
例一：無縫克隆在CRISPR中的應用。
CRISPR介導的基因敲除依賴於Cas9等內切酶，以及幫助內切酶定位到指定位點的gRNA。在一個細胞系中同時敲除多個基因，雖可以通過轉染多個gRNA表達載體來實現，但這種方案存在隨機性，並不能保證每個細胞都能獲得所有的gRNA載體。而通過無縫克隆，我們可將多個U6啟動子和gRNA序列（包括spacer和scaffold）元件串聯起來，實現一個質粒表達多個gRNA。
（Tips
4：目前還有其他多種multiplex CRISPR的方案，各有優缺點。請自行查閱文獻，本文不贅述。）
基因定點敲入（knock-in），需要在打靶區域DNA產生雙鏈斷裂，並以含有上下遊兩段同源臂外加插入基因序列的供體作為修復模板，實現外源序列的插入。簡而言之，供體質粒需要含有5’同源臂 + 插入序列 + 3’同源臂，以及基本質粒骨架（含有ori、抗性基因等基本元件，方便生產供體質粒）共計4個部分構成（見下圖）。通過無縫克隆，我們可以輕松地將這4部分片段通過一步反應拼接出來。
例二：用無縫克隆構建多順反子表達載體。
將EGFRvIII基因、P2A多順反子元件、iRFP720基因拼接到pLVX-TetOne載體中（如下圖），實現Tet-on誘導表達EGFRvIII基因，同時還能表達iRFP720基因，用於小動物活體熒光成像。
（Tips
5：有關多順反子元件的介紹，請閱讀本專欄的另一篇文章 多順反子表達元件——一次滿足你N個願望）
假如使用雙酶切克隆，你會發現，隻有AgeI和BstZ17I酶切位點可用於EGFRvIII基因克隆，因為另外兩個酶切位點同時存在於該基因內部。而P2A元件和iRFP720基因必須和EGFRvIII基因處於同一個讀碼框，我們沒有辦法使用AgeI進行後續的克隆瞭。
本司機的做法是，直接用PCR構建出各個部件，然後通過無縫克隆一步組裝。這幾個部件分別是：
1、pLVX-TetOne載體的一半；
2、pLVX-TetOne載體的另一半；
3、EGFRvIII；
4、P2A + iRFP720。
將pLVX-TetOne通過PCR拆成兩半的原因是：質粒超過8 kb，直接通過PCR線性化整個質粒的突變幾率，比擴增兩個4 kb的片段要略高一些。同時，由於兩個4
kb片段在跑瓊脂糖時，可以和8 kb的環狀PCR模板區分開來，因此可以直接切膠回收，而不需預先進行DpnI去除環狀質粒，即可實現零背景的轉化。
（Tips 6：線性化質粒也可以通過單酶切或雙酶切來實現。）
P2A元件非常短，僅有66 bp，很可能被T5外切酶徹底降解。不過，我們隻需通過兩輪PCR，在擴增iRFP720基因的上遊引物的5’端引入部分P2A序列（每次引入33個堿基），即可獲得P2A
+ iRFP部件。
（Tips
7：有關無縫克隆的引物設計，可直接使用所購試劑盒廠傢的線上工具。我個人比較喜歡用NEBuilder HiFi
DNA Assembly，傳送門 NEBuilder Assembly Tool。使用之前，可以用Word等文本編輯軟件，將所要拼接的序列按5’→3’依次排好，用不同顏色區分標註，然後再挨個粘貼到線上設計工具中即可。此外，該試劑盒似乎通過調整酶濃度和buffer的離子濃度，克服瞭T5外切酶對ssDNA的活性，從而可以用ssDNA
oligo橋接任何dsDNA片段。具體內容請參考NEB公司的宣傳頁面。）
四、目前存在的問題
吹瞭半天，無縫克隆其實也不是完美的。細心的讀者可能已經發現，前面提到，P2A太短無法直接拼接。是的，無縫克隆目前無法組裝小片段，因其可能會被T5外切酶徹底降解。Addgene blog指出，用於Gibson assembly的片段最好不低於200 bp，而NEB官方的線上設計軟件，強制輸入片段的長度必須大於75
bp，並提示最好不低於110 bp。
（註：NEBuilder試劑盒號稱可用短至60
nt的單鏈oligo橋接兩個dsDNA，或者在橋接的同時在兩者之間引入短片段，而其他試劑盒做不到，具體機制正如前文所提的T5外切酶對ssDNA的活性。但本人並未親測是否真實可靠。）
其次，由於無縫克隆依然依賴於前後兩條同源臂黏性末端的互補配對，假設黏性末端內部恰好形成瞭穩定的二級結構（如發夾結構），無縫克隆的效率便會顯著降低。雖然這隻是個概率的問題，但萬一實驗失敗，在洗完臉後，不妨檢查一下同源臂及臨近序列會不會產生穩定的二級結構。（註意：反應溫度是50℃，也不算低瞭，通常隻有臉太臟的時候才會這麼倒黴。）
最後，無縫克隆中所使用的連接酶，是有所謂的“保真性”的。DNA連接酶所實現的功能，是催化形成磷酸二酯鍵，將兩個脫氧核苷酸連接起來。這同時也意味著，我們並不希望見到，含有錯配互補序列的片段，也被連接起來。經典酶切克隆法使用的是保真度低、即對錯配容忍度極高的T4
DNA連接酶。但由於酶切克隆所產生的黏性末端是完全一致的，因此基本不可能出現問題。而無縫克隆雖然借助瞭序列完全一致的同源臂，但T5外切酶並不能保證僅消化同源臂的部分。再加上在互補配對時，長鏈黏性末端極易隨機產生不完美的配對，因此導致拼接錯誤。DNA連接酶的保真度，是由酶的類型，以及反應條件（溫度、緩沖液pH、鹽強度等）決定的。不同無縫克隆試劑盒的廠傢，可能有不同的配方，至於哪個最適合你，就隻能靠自己摸索瞭。而至於DNA聚合酶的保真性，由於需要合成的堿基數少，並非傳統的PCR應用，因此一般不會在這個環節翻車。