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實驗專欄丨一文掌握CCK-8細胞增殖與毒性檢測法,你值得瞭解!

今天要為大傢介紹的是:CCK-8實驗的操作步驟和註意事項。

CCK-8,英文全稱是Cell Counting Kit-8。CCK-8試劑盒可用於簡便而準確的細胞增殖和細胞毒性分析。

實驗原理

CCK-8試劑盒中,最主要化學藥品是WST-8【化學名為2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑單鈉鹽】,它在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯(1-Methoxy PMS)存在的情況下,能夠被細胞線粒體內的一些脫氫酶還原成具有高度水溶性的橙黃色甲臢染料(Formazan)。

也就是說,活細胞數量越多,生成的甲臢量就越多,相應地顏色也就越深。因此可以用這一特性直接進行細胞增殖和毒性分析:細胞增殖越快,顏色越深;細胞毒性越大,顏色則越淺。(對於同樣的細胞,顏色的深淺和細胞數目呈線性關系。)

使用酶標儀在450nm波長處測OD值,可間接性反應活細胞的數量。是一種高靈敏度,無放射性的比色檢測法。

(CCK-8實驗原理)

因此,CCK-8實驗可用於細胞因子等誘導的細胞增殖檢測,也可以用於抗癌藥物等對細胞有毒試劑誘導的細胞毒性檢測,或一些藥物誘導的細胞生長抑制檢測。

操作步驟

(一)實驗材料及試劑:

酒精燈、移液槍、酶標儀(帶有450nm濾光片)、96孔培養板、CO2培養箱、CCK-8、細胞計數板、PBS等。

(二)繪制標準曲線

1.制備細胞懸液:選取生長狀態良好的對數生長期細胞制作細胞懸液,並計數。

2.在96孔板中接種細胞懸液 (100 μL/孔) :按比例依次用培養基等比稀釋成一個細胞濃度梯度,一般要做5-7個細胞濃度梯度(比如,稀釋10倍,100倍……),每組4-6個復孔。

3.繪制標準曲線:接種後培養一定時間待細胞貼壁後,然後每100μL培養基加10μL(10%)CCK-8試劑培養一定時間後測定OD值,制作出一條以細胞數量為橫坐標,OD值為縱坐標的標準曲線。

根據此標準曲線可測定出未知樣品在條件一致的前提下的細胞數。

標準曲線還有助於確定細胞接種的合適數量以及摸索CCK-8後所需孵育時間。

(三)實驗:細胞增殖檢測

1.制備細胞懸液:選取生長狀態良好的對數生長期細胞制作細胞懸液,並計數。

2.在96孔板中接種細胞懸液 (100 μL/孔) :根據合適的鋪板細胞數(根據自身的細胞類型而定,以一周能鋪滿為宜,若為血液細胞密度可適當增大),每孔接種約100ul細胞懸液,每組設置4-6個復孔。①當使用標準96孔板時,貼壁細胞的最小接種量至少為1000 個/孔(100μl培養基)。檢測白細胞時的靈敏度相對較低,因此推薦接種量不低於2500 個/孔(100μl培養基)。懸浮細胞由於染色比較困難一般需要增加細胞數量和延長培養時間。

②當在培養箱內培養時,培養板最外一圈的孔最容易幹燥揮發,由於體積不準確而增加誤差。為減少誤差,最外一圈的孔隻加100ul PBS、水或者培養液,不作為測定孔用。

③接種時註意細胞懸液一定要混勻,以避免細胞沉淀下來,導致每孔中的細胞數量不一致。3.將培養板置於培養箱中預培養(37℃,5% CO2)12-24小時,使細胞達到指數期(培養時間根據細胞種類的不同和每孔內細胞數量的多少而異)。

4.每孔加入10ul CCK-8試劑①由於每孔加入CCK-8量比較少,有可能因試劑沾在孔壁上而帶來誤差,建議直接配置含10% CCK-8培養基(現用現配)以換液的形式加入。註意加CCK-8試劑時不要在孔中生成氣泡,它們會影響OD值的讀數。加CCK-8試劑時速度要快,減少試劑在移液器上的殘留,加入CCK-8試劑後輕輕震培養板。

②加CCK-8試劑時間可分別在22h、46h、70h、94h時加入,也可以在24h、48h、72h、96h時再加入。重要的是需保證實驗組和對照組在同一時間點進行實驗。

③若細胞培養時間較長,培養基顏色或 pH 發生變化,建議更換培養基後再加 CCK-8。5.將培養板置於培養箱內繼續培養0.5-4小時①培養時間因孔中細胞的類型和數量而異,需要自己摸索,因為細胞種類不同,形成Formazan的量也不一樣。

②如果顯色太淺的話,可以將96孔板置於37℃細胞培養箱中繼續培養,可參考標準曲線確定培養時間。

③一般情況下,白細胞著色較弱,因此可能需要較長的孵育時間(最多 4 h)或增加細胞數量。

④CCK-8 的最佳反應時間以具體顯色的最佳時間為準。可在0.5h、1.0h、2.0h分別觀察培養基的顏色。最佳OD 值控制在1.0左右較合適。6.使用酶標儀檢測450nm波長的吸光度(OD值)。實驗重復3次,取實驗結果的平均值作為最終實驗結果。

空白對照的設定:在同體積的完全培養基中加入CCK-8,培養同樣的時間,和實驗組一起測定450nm的吸光度。①使用酶標儀檢測時記得打開96孔板蓋子,需保證板子的表面以及板底是幹凈的,且每個待測孔內沒有氣泡,以免幹擾實驗結果。

②如果結果出現“overflw”則需降低細胞接種密度,如果因實驗需要不能減少細胞數時可縮短加入CCK-8後的培養時間。

③如果樣品為高渾濁的細胞懸液,建議采用雙波長進行測定,檢測波長450-490nm,參比波長600-650nm。(CCK-8 在參比波長處沒有吸光值,設定參比波長的目的是為瞭去除由於樣品渾濁所帶來的吸收。)

④若暫時不測定OD值,可以向每孔中加入10μL 0.1M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液,並遮蓋培養板避光保存在室溫條件下。24小時內測定,吸光度不會發生變化。

(四)實驗:細胞毒性檢測

除瞭需要對細胞進行待測藥物幹預外,其他步驟與細胞活性檢測基本相同。

1.制備細胞懸液:選取生長狀態良好的對數生長期細胞制作細胞懸液,並計數。

2.在96孔板中接種細胞懸液 (100 μL/孔)。

3.將培養板置於培養箱中預培養(37℃,5% CO2)12-24小時,使細胞達到指數期(培養時間根據細胞種類的不同和每孔內細胞數量的多少而異)。

4.吸出各孔培養基,向培養板加入10μL不同濃度的待測藥物進行幹預。(實驗組加入含不同濃度藥物的培養基,空白組加入不含藥物培養基)

5.將培養板在培養箱(37℃,5% CO2)培養一段適當的時間(例如:6、12、24或48小時,具體時間一般根據細胞周期來決定)。

6.每孔加入10ul CCK-8試劑。

①在做加藥實驗時,還應考慮藥物的吸收。如果實驗中待測物質有氧化還原劑,在不含細胞的培養基中加入藥物,然後加入CCK-8試劑在一定時間內檢測,和不加藥物的培養基進行比較(隻加CCK-8試劑),如果OD值明顯偏高,則說明有反應。

②可在加CCK-8之前更換新鮮培養基(除去培養基,並用培養基洗滌細胞兩次,然後加入新的培養基),去掉藥物對實驗的影響。

③當然藥物影響比較小的情況下,可以不更換培養基,直接扣除培養基中加入藥物後的空白吸收即可。

5.將培養板置於培養箱內繼續培養1-4小時:

6.使用酶標儀檢測450nm波長的吸光度(OD值)

按公式計算:

細胞活力(%)=[(As-Ab) / (Ac-Ab)] × 100%

細胞抑制率(%)=[(Ac-As) / (Ac-Ab)] × 100%

As: 實驗組吸光度 (含細胞、培養基、CCK-8 溶液和藥物溶液);

Ac: 對照組吸光度 (含細胞、培養基、CCK-8 溶液,不含藥物);

Ab: 空白組吸光度 (含培養基、CCK-8 溶液,不含細胞、藥物)。

註:細胞活力指細胞增殖活力或細胞毒性活力。

註意事項

  • 由於CCK-8是通過和細胞內的脫氫酶進行反應間接反映活細胞數量,如果細胞已經死亡,但脫氫酶的活性還在,則試劑測定的細胞數量將會比真實值高,不能真實反映活細胞數量,建議采用別的方法測定。
  • 由於 CCK-8 分析基於活細胞中脫氫酶活性的檢測,因此影響活細胞中脫氫酶活性的條件或化學物質可能會導致實際活細胞數與使用 CCK-8 分析確定的細胞數之間存在差異。
  • 考慮到不同類型細胞代謝水平存在差異,有些細胞在藥物處理後,可能活細胞數不變,但是有氧代謝能力降低後,NAD+產生減少,測出的Formazan也會減少。
  • CCK8可以檢測大腸桿菌,但不能檢測酵母細胞。
  • 在細胞增殖實驗每次測定的過程中需要避免細菌污染,以免影響結果。
  • 金屬對CCK-8顯色有影響:當終濃度為1mM的氯化亞鉛、氯化鐵、硫酸銅會抑制5%、15%、90%的顯色反應,使靈敏度降級。如果終濃度是10 mM的話,將會100%抑制。
  • CCK-8試劑的顏色為淡紅色,與含酚紅的培養基顏色接近,不註意的話容易產生漏加或多加。酚紅和血清對CCK-8法的檢測不會造成幹擾,可以通過減去空白孔中本底的吸光度而消除。
  • 混合或重懸組分時,避免產生氣泡,因為它們會影響OD值讀取。
  • 第一次做實驗時,建議先做幾個孔摸索接種細胞的數量和加入CCK-8試劑後的培養時間。
  • CCK-8反復凍融會增加背景值,幹擾實驗測定。

CCK8的說明書大傢一定要認真閱讀,裡面很多細節的問題都有提到。而且說明書裡提供的一些關於各種細胞的種板數都很有參考價值,因為那是反復驗證過的最佳數值。

優點

1、使用方便,CCK-8細胞活性檢測試劑中為1瓶溶液,可以直接加入到細胞樣品中(懸浮和貼壁細胞均適用),不需要預配各種成分,不需要對細胞進行過多的處理,也不必添加放射性同位素、有機溶劑等,且能夠快速進行檢測;

2、CCK-8法的檢測靈敏度很高,甚至可以測定較低細胞密度;

3、CCK-8法的重復性優於MTT 法,MTT 實驗生成的formazan 不是水溶性的,需要使用DMSO 等有機溶劑溶解;

4、而本方法產生的formazan 是水溶性的,不僅省去瞭溶解步驟,更因此而減少瞭該操作步驟帶來的誤差;

5、CCK-8法對細胞毒性小,可以多次測定選取最佳測定時間,與MTT 方法相比線性范圍更寬,靈敏度更高;

6、CCK-8 對細胞的毒性非常低,其他的實驗,例如中性紅法或結晶紫法 ,也可在 CCK-8 法檢測完後繼續進行。

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