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細胞遷移/侵襲實驗大揭秘

細胞遷移和侵襲是生物學研究中常見的現象,也是疾病發展過程中重要的環節。細胞遷移/侵襲實驗作為一種常用的生物醫學實驗,旨在評估細胞的侵襲和遷移能力,尤其是對細胞在模擬體內的生理環境下的行為進行模擬和觀察,一般在腫瘤惡性化表型研究中最常見。因為在腫瘤治療中,普遍認為抑制腫瘤細胞遷移和侵襲是有效的治療手段。因此在對腫瘤細胞進行幹預(過表達、敲低、敲除、點突變、藥物處理)後對細胞的遷移與侵襲能力進行檢測,可以作為評估幹預效果的一個有效指標。

▲腫瘤細胞侵襲模型(Novikov et al., 2021)。

一、細胞遷移/侵襲簡介

細胞遷移(Cell Migration)也稱為細胞爬行、細胞移動或細胞運動,是指細胞在接收到遷移信號或感受到某些物質的梯度後而產生的移動。細胞遷移為細胞頭部偽足的延伸、新的黏附建立、細胞體尾部收縮在時空上的交替過程。細胞遷移是正常細胞的基本功能之一,是機體正常生長發育的生理過程,也是活細胞普遍存在的一種運動形式。在胚胎發育、血管生成、傷口愈合、免疫反應、炎癥反應、腫瘤轉移等多個過程中都涉及到細胞遷移。由於轉移性疾病是導致癌癥死亡的關鍵因素,因此瞭解細胞遷移機制對於癌癥研究至關重要。

細胞侵襲(Cell Invasion)是細胞遷移的一種,與細胞遷移密不可分,是指細胞在原位突破基底膜,然後內滲進入血管、淋巴管的過程,即入侵的細胞(如惡性腫瘤細胞)穿過胞外基質層(Extracellular Matrix,ECM)或基底膜基質層(BME)從一個區域侵入到另一個區域,在侵襲到新區域之前,ECM/BME被細胞內的蛋白酶降解。細胞侵襲常發生於傷口修復、血管形成和炎癥反應以及組織的異常浸潤、腫瘤細胞轉移等過程中。因此,研究其中的機制對多種生理/病理過程都有著重要的意義。而腫瘤細胞的侵襲性是腫瘤相關信號通路、藥物治療、靶向治療、致癌/抑癌基因等腫瘤學研究的一個重要指標。

檢測細胞遷移能力最常見的方法是細胞劃痕實驗和Transwell小室檢測,兩者的區別在於細胞劃痕簡單經濟,模擬單層細胞在2D平面的遷移;而Transwell成本較高,模擬細胞在3D空間的遷移。另外,Transwell也是檢測細胞侵襲能力最常用的手段。

二、細胞劃痕實驗

細胞劃痕實驗(Scratch Assay or Wound Healing)是一種操作簡單,經濟實惠的研究細胞遷移的體外試驗方法,類似體外傷口愈合模型,主要是用來檢測細胞在2D空間中的一個遷移能力。是在體外培養皿或平板培養的單層貼壁細胞上,用微量槍頭或其它硬物在細胞生長的中央區域劃線,去除中央部分的細胞,然後繼續培養細胞至實驗設定的時間,依據劃痕邊緣細胞逐漸進入空白區域使“劃痕”愈合的能力,判斷細胞生長遷移能力。因其類似體外傷口愈合過程,又名傷口愈合實驗。

基本原理:

當細胞長到融合成單層狀態時,在融合的單層細胞上人為制造一個空白區域,稱為“劃痕”,劃痕邊緣的細胞會逐漸進入空白區域使“劃痕”愈合,在一定程度上模擬瞭體內細胞遷移過程。

圖1 劃痕實驗示意圖(Hulkower et al., 2011)。

操作步驟:

培養板劃線—鋪板—細胞劃線—清洗—細胞培養觀察—結果分析

註意事項:

1、鋪板時一般選擇6孔板,因為6孔板大小適中,可保證有相當距離的平直劃痕,便於觀察。而且因為有5條定位線,與劃痕相交,這樣就有10個可固定監測點,不作重復,誤差也很小。但是如果實驗需要高通量初篩,也可以用12或24孔板。

2、實驗時應註意細胞生長狀況,選擇適當的細胞接種濃度。對不同類型細胞要觀察細胞貼壁率等,確定實驗時細胞種板數量和培養時間,保證培養終止時密度適當。

3、減少細胞增殖對實驗結果的影響,應選擇加入無血清或血清濃度低(≤2%)的培養基進行細胞培養。

細胞劃痕的優點:

1、操作簡便,不需要借助特殊的實驗儀器;2、實驗成本低。

細胞劃痕的缺點:

1、操作者劃痕易出現寬度不均一,影響劃痕愈合度評估;2、劃痕會對周圍細胞造成機械損傷,影響細胞活性;3、不太好排除增殖帶來的影響。

三、Transwell小室檢測

Transwell顧名思義是“穿孔實驗”,即將小室放入孔板中(常見的是24孔板),小室中含有密密麻麻的小孔,將細胞懸液加到小室中,小室放在加入完全培養基的24孔板內,細胞可通過形變穿過小室中的孔而跑到營養更豐富的小室外部並貼在外側。通過對小室外部的細胞進行染色計數,就可以判斷細胞的遷移與侵襲能力的強弱。

基本原理:

細胞遷移與侵襲實驗就是將小室放入培養板中,小室內稱為上室,培養板內稱為下室,上下層培養液以聚碳酸酯膜相隔,上室內添加上層培養液,下室內添加下層培養液。將細胞種在上室內,由於膜有通透性,下層培養液中的成分可以影響到上室內的細胞,從而可以研究下層培養液中的成分對細胞生長、運動等的影響。

圖2 Transwell實驗原理圖。

應用不同孔徑和經過不同處理的濾膜,可進行共培養、細胞趨化、細胞遷移、細胞侵襲等多方面研究。由於不同細胞的體積不同,選擇時需考慮到細胞大小。這裡主要談幾種常用實驗:

1、共培養體系

細胞在濾膜孔徑小於3.0μm的條件下不會通過,因此,若研究不涉及細胞運動能力、不需細胞穿過濾膜時,則應選擇3.0μm以下孔徑。將細胞A種於上室,細胞B種於下室,可研究細胞B分泌或代謝產生的物質對細胞A的影響。

2、趨化性實驗

上室細胞可穿過濾膜進入下室,計數進入下室的細胞量則可反映下室成分對上室細胞的趨化能力,詳情如下:

(1)細胞B對細胞A的趨化作用:將細胞A種於上室,細胞B種於下室,研究細胞B分泌或代謝產生的物質對細胞A的趨化作用;

(2)趨化因子對細胞的趨化作用:將細胞種於上室,下室加入某種趨化因子,研究該趨化因子對細胞的趨化作用。

3、腫瘤細胞遷移實驗

上室種腫瘤細胞,下室加入FBS或某些特定的趨化因子,腫瘤細胞會向營養成分高的下室遷移,計數進入下室的細胞量可反映腫瘤細胞的遷移能力。

4、腫瘤細胞侵襲實驗

與腫瘤細胞遷移實驗類似,但與腫瘤細胞遷移實驗不同的是,上室需鋪上一層基質膠(常用人工重構基底膜材料Matrigel)以模仿體內細胞外基質(ECM),細胞欲進入下室,先要分泌基質金屬蛋白酶(MMPs)將基質膠降解,方可通過聚碳酸酯膜。計數進入下室的細胞量可反映腫瘤細胞的侵襲能力。

Transwell細胞遷移操作步驟:

細胞培養與處理—Transwell小室準備—制備細胞懸液—接種細胞至上方小室—細胞固定—細胞染色—封片—細胞觀察計數

註意事項:

1、選擇實驗細胞時需保證細胞狀態良好;

2、放入小室時,小心不要產生氣泡。如果有氣泡,請小心輕拍底板的側面以清除氣泡;

3、細胞固定時用棉簽擦去未遷移細胞時需要控制力度務必小心,不要戳破底部膜,更不要擦去已穿膜的細胞;

4、對於難穿膜的細胞可以進行饑餓處理後再進行相關實驗。

Transwell細胞侵襲操作步驟:

細胞培養與處理—包被基底膜—水化基底膜—制備細胞懸液—接種細胞至上方小室—細胞固定—細胞染色—封片—細胞觀察計數

註意事項:

1、Matrigel是一種細胞外基質,4℃時是液體,在22-35℃時快速成膠,溶解時需在4℃冰上過夜凍融,所有用品在使用前需置於冰浴,必須使用預冷的移液管、吸頭及小管操作Matrigel;

2、可將凍融後的Matrigel分裝在多個小管,所有分裝均需用預冷的凍存管,迅速冷凍並保存,避免多次凍融。

參考文獻

Novikov N M, Zolotaryova S Y, Gautreau A M, et al. Mutational drivers of cancer cell migration and invasion[J].Br J Cancer 124, 102–114 (2021).Hulkower KI, Herber RL. Cell migration and invasion assays as tools for drug discovery.Pharmaceutics. 2011;3(1):107-124

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