酵母單雜、酵母雙雜、酵母三雜，僅僅一個字的區別，你對它們瞭解嗎？這些經常用到的實驗，它們的原理你確定都搞清楚瞭嗎？如果沒有，那麼今天你就來對地方瞭，因為伯小遠下面打算非常詳細的給你講一遍它們的原理，讓你以後不再為不懂原理而煩惱！
在瞭解酵母雜交實驗之前我們先來瞭解一個轉錄因子——Gal4，瞭解它可以幫助大傢更好的理解酵母雜交實驗的原理！
Gal4轉錄因子
真核基因轉錄受大量調控因子調節。進化保守的Gal4是真核細胞普遍存在的轉錄激活因子。在半乳糖的誘導下，酵母Gal4結合在半乳糖代謝酶系GAL基因啟動子的上遊激活序列（Upstream activating sequence，UAS）上，調控Galactokinase（Gal 1），Galactose permease（Gal2），Galactose 1-phosphate uridyltransferase（Gal7），Galactose mutarotase and UDP-galactose 4-epimerase（Gal10）等基因的轉錄。
酵母單雜交與酵母雙雜交
酵母單雙雜實驗的意義
生物體內各種生物分子之間的復雜調控網絡構成瞭生命過程的基礎。這些網絡控制著胚胎如何發育成多細胞生物、該生物如何維持穩態以及如何對病原體或疾病作出反應等。參與這些網絡的生物分子包括DNA、RNA、蛋白質和代謝產物等小分子。這些生物分子之間一般會存在相互作用共同調控復雜的生命過程，為瞭解析這些相互作用，酵母單雜、酵母雙雜就成為瞭必不可少的研究手段！
酵母單雜原理
酵母單雜（Y1H）是在酵母雙雜的基礎上發展而來的，按理說應該先介紹酵母雙雜的原理，但是考慮到酵母雙雜還存在核體系與膜體系的區別，這裡就先介紹酵母單雜吧！
基本的Y1H分析包括兩個載體（圖1）：（1）包含感興趣的DNA（通常被稱為誘餌（Bait））和報告基因融合的載體，該報告基因編碼的蛋白易於檢測；（2）包含感興趣的轉錄因子（TF，通常被稱為獵物（Prey））和酵母轉錄激活域（AD）融合的載體。這兩種載體都被轉入到合適的酵母菌株中，如果TF在酵母核的環境中與DNA結合，那麼AD就會誘導報告蛋白的表達。重要的是，無論TF是激活因子還是抑制因子，酵母AD都會激活報告因子，因此，Y1H分析的是蛋白質和DNA之間的相互作用。
圖1 酵母單雜實驗原理(Ouwerkerk, Pieter BF.and Annemarie H., 2001)（不同的實驗體系可能會存在一些差異，但原理基本都差不多，這裡主要幫助大傢理解原理）。
圖2 Y1H分析的變化和註意事項概述(Sewell Jared A.and Juan I. Fuxman Bass, 2018)。利用限制性內切酶（RE）或Gateway技術將復雜調控區、轉錄因子結合基序或非編碼變異的DNA序列克隆至報告基因上遊。這些結構最常被整合至酵母基因組中以產生DNA誘餌菌株。然後將DNA誘餌菌株轉化或與一組獵物克隆（ORF融合到Gal4的激活結構域AD上）交配。編碼獵物的載體可以是低拷貝（ARS/CEN）或高拷貝（2μ）的。篩選可以以文庫進行篩選，其中陽性菌落必須進行測序和重新測試，同時，也可以以陣列的形式進行篩選，陽性菌落的位置表明相互作用的轉錄因子（TF）的身份。
說明：酵母單雜篩庫是以DNA為誘餌篩選與其互作的轉錄因子，如果你想要通過轉錄因子篩選與其互作的DNA，用到的方法應該是ChIP-seq。這個大傢一定要區分清楚哦！
酵母雙雜原理
（1）核體系酵母雙雜
1989年，Fields和Song通過描述一個遺傳系統來檢測酵母細胞(Fields Stanley and Ok-kyu Song,1989)中蛋白質-蛋白質的直接相互作用，從而徹底改變瞭蛋白質相互作用分析的研究方法。在此之前，兩種蛋白質之間的相互作用主要是利用生化技術來進行研究的。這一全新的分析工具的發現是由真核轉錄因子的分子分析引發的。在該項發現被公佈的前幾年，Ptashne實驗室發現瞭酵母中轉錄激活因子Gal4的模塊化結構。他們表明，Gal4結合一個特定的DNA序列（上遊激活序列，UAS），從而在半乳糖存在的情況下激活轉錄。如果分離成兩個片段，N端片段仍然可以與DNA結合，但在半乳糖存在時不激活轉錄，而激活的功能是由C端片段(Keegan et al., 1986)介導的。然而，這兩個片段可以相互作用和非共價重建成一個有功能的Gal4。因此，研究者確定瞭Gal4的兩個不同功能域：N端DNA結合域（DBD）和C端DNA激活域（AD），這兩個獨立的功能域獨立於另一個的存在而保持各自的功能。
受這些發現的啟發，Fields和Song利用轉錄因子Gal4的模塊化特性來監測蛋白質之間的相互作用。其基本思想是將感興趣的兩個蛋白X和Y分別融合到Gal4的DBD和AD上，這樣X和Y之間的相互作用可以重建Gal4轉錄因子的功能，然後驅動報告基因的表達（圖1）。在第一個誘餌結構中，蛋白質X（如葡萄糖傳感器SNF1）被融合到含有DBD的GAL4的N端部分（GAL4DBD）。在第二個獵物結構中，獵物蛋白Y（如調控蛋白SNF4）被融合到含有AD的Gal4的C端部分（GAL4AD）。融合蛋白在酵母中的表達以及誘餌和獵物之間的相互作用讓Gal4兩個分開的功能域重組成一個功能性的Gal4轉錄因子。然後Gal4招募RNA聚合酶II，引發GAL1-lacZ融合基因的轉錄和表達。lacZ報告基因編碼半乳糖苷酶，可使用比色底物標記酵母細胞進行檢測(Fields Stanley and Ok-kyu Song,1989)。
圖3 酵母雙雜實驗原理(Brückner et al., 2009)。（A）感興趣的蛋白質X，被融合到DNA結合域（DBD），該結構被稱為誘餌。潛在的相互作用蛋白Y被融合到激活域（AD）上，該結構被稱為獵物。（B）誘餌，即DBD-X融合蛋白，結合啟動子的上遊激活子序列（UAS）。誘餌與獵物（即AD-Y融合蛋白）的相互作用，招募AD，從而重建一個功能性轉錄因子，導致RNA聚合酶II的進一步招募和報告基因的後續轉錄。
圖4 蛋白SNF1與SNF4互作示意圖(Stynen et al., 2012) 。
核體系酵母雙雜的衍生應用
應用一
自從酵母雙雜交技術開發以來，就被證明是檢測蛋白質相互作用的有力工具。在另一方面，有機配體的二聚體可以導致與受體融合的兩個獨立蛋白質的二聚或寡聚。為瞭使酵母雙雜交系統能夠用於研究小分子配體與受體的相互作用，研究者設想使用兩個不同的小有機配體合成異源二聚體作為第三個雜化分子，使DNA結合結構域與其中一個配體的受體融合，激活結構域與第二個配體的受體融合，從而激活報告基因。該系統被稱之為酵母三雜交系統，可以用於直接識別編碼感興趣的配體的受體cDNA，或篩選與特定受體結合的新配體。
圖5 酵母三雜交系統的圖解示意圖(Licitra Edward J and Jun O Liu., 1996)。合成“誘餌”雜交配體由配體A（正方形）和配體B（半圓形）通過連接劑連接而成。“魚鉤”融合蛋白由配體A受體與轉錄因子的DNA結合域融合而成。“魚”融合蛋白由配體B的受體融合到轉錄因子的反式激活結構域組成。“魚鉤”、“魚餌”和“魚”形成一個三聚體復合體，由此使得轉錄激活域和DNA結合域的重組從而導致報告基因的激活。
應用二
將酵母雙雜系統進行簡單的改造之後，除瞭上面講到的用於研究受體與配體之間的互作之外，還可以用來研究3個蛋白之間的互作，具體信息如下：
圖6 酵母三雜交系統(Causier Barry and Brendan Davies, 2002)。該系統也是基於經典的酵母雙雜交系統，蛋白質X和Y分別在具有轉錄因子DNA結合域和轉錄激活域的載體內表達。第三種蛋白Z在酵母細胞核中表達，沒有添加任何結構域。蛋白質Y可能隻在Z存在的情況下與X相互作用。通過X和Z相互作用形成的結構域可能為蛋白質Y（i）提供瞭一個相互作用界面。或者，蛋白質Z也可以作為蛋白質X和蛋白質Y之間的橋梁（ii）。
應用三
小分子配體在探索蛋白質的細胞功能方面具有不可估量的價值。這些配體的結合導致其目標蛋白的激活或失活，類似於相應基因中功能獲得或喪失突變所產生的效應。利用具有細胞滲透性的小分子配體來改變蛋白質的功能是很有吸引力的，因為其固有的條件可以通過添加或移除這種化合物來簡單、快速地控制目標蛋白的活性。為瞭研究目標蛋白對應的小分子配體是什麼，在酵母雙雜的基礎上開發以下方法：
圖7 用於檢測蛋白質相互作用的小分子抑制劑的反向雙雜交系統的示意圖(Huang Jing and Stuart L Schreiber, 1997) 。該系統也是基於經典的雙雜交系統，但是與經典雙雜交系統不一樣的是報告基因的表達在一定條件下對酵母細胞是有毒的。相互作用蛋白的表達由GAL1啟動子控制，在Glc中被抑制。在Gal誘導後，兩個相互作用的蛋白質被合成，它們的結合反過來會誘導合成一種有毒的基因產物，導致細胞死亡，除非在細胞中存在一種蛋白質相互作用的抑制劑。通過這種方式驗證抑制蛋白互作的小分子或目標蛋白的小分子配體。
（2）膜體系酵母雙雜
傳統酵母雙雜交系統的各種修飾在確定或檢測細胞核和細胞質蛋白之間的蛋白-蛋白相互作用中發揮瞭重要作用，其原理是基於轉錄因子（TF）活性的重建，其過程必須發生在細胞核中(Fields Stanley and Ok-kyu Song, 1989)。這種方法可以識別新的互作蛋白，並為它們的功能提供線索。然而，膜蛋白，如受體酪氨酸激酶、G蛋白偶聯受體、膜結合磷酸酶和轉運蛋白等重要的信號分子，由於其疏水性，很難使用經典的蛋白質相互作用分析方法進行研究。因此，需要尋找另外一種方法對其進行研究，並且該方法允許識別完整的膜相互作用蛋白。對這一塊知識比較瞭解的應該都知道該方法就是膜體系酵母雙雜交（MbYTH）。
MbYTH系統是基於觀察到的一個現象，即泛素（Ub）可以通過實驗被分離成兩個基團，當它們靠近彼此時，其功能又可以進行重構 (Johnsson Nils and Alexander Varshavsky, 1994)。因此，分裂泛素的重組就可以用來研究融合到泛素部分的膜蛋白的相互作用(Stagljar et al., 1998)。那麼，泛素到底是什麼呢？泛素是一種進化保守的，包含76個氨基酸的蛋白，可作為26S蛋白酶體降解目標蛋白的標簽。泛素的存在被位於所有真核細胞細胞核和細胞質中的泛素特異性蛋白酶（UBPs）識別。
MbYTH系統中也包括兩個載體：（1）將一種感興趣的膜蛋白，即所謂的誘餌，融合到半個泛素（Cub，即泛素分子被截斷後的C端）上，並且Cub上還連有一個人工TF，該TF由細菌LexA-DNA結合域和單純皰疹病毒VP16激活蛋白組成；（2）將另一種感興趣的蛋白，即所謂的獵物，它們要麼是膜蛋白，要麼是細胞質蛋白，融合到半個泛素（Nub，即泛素分子被截斷後的N端）上。
Cub與Nub在同一個細胞中存在時能夠自發重組形成有活性的泛素，因此將Nub中的第13位亮氨酸突變為甘氨酸或丙氨酸（NubI-NubG或NubA）後，可使它與Cub之間的親和力降低，從而可以避免這種自發重組。在這些突變體中，隻有當分別與NubG/A和Cub融合的兩個蛋白間有相互作用時，才能在空間上使NubG/A和Cub足夠接近形成可以被UBPs識別的泛素，隨後UBPs將融合於Cub的C端末端的TF解離釋放。釋放的TF隨後進入細胞核，激活報告基因如HIS3、LacZ、ADE2的轉錄與表達，這個可以通過酵母在選擇板上的生長或比色法進行監測（圖8）。
圖8 膜體系酵母雙雜概述(Iyer et al., 2005)。（A）一個感興趣的膜誘餌蛋白與Cub融合，然後是人工轉錄因子LexA-VP16（藍色），而另一個獵物膜蛋白（或細胞質蛋白）融合到NubG結構域（紅色）上。如果誘餌和獵物不存在相互作用，則不會發生泛素重組，也不會發生UBPs介導的轉錄因子裂解；這導致酵母HIS3-/ADE2-和LacZ-的結果。（B）當誘餌和獵物蛋白相互作用時，泛素發生重組，導致UBPs的蛋白水解裂解和轉錄因子的釋放。該因子進入細胞核，通過與啟動子內的Lex A操作位點（lexA ops）結合來激活報告基因。這導致酵母HIS3+/ADE2+和LacZ+的結果。
這種所謂的分裂泛素膜酵母雙雜交實驗涉及將泛素的一半融合到兩個相互作用的蛋白質中，其中至少有一個是膜結合的。在這兩種蛋白的相互作用下，切斷的泛素被聚集在一起，融合到膜蛋白上的轉錄因子被裂解並釋放。自由轉錄因子進入細胞核，激活報告基因的轉錄。
酵母三雜
酵母三雜實驗的意義
在細胞中，RNA與蛋白質的相互作用對於包括病毒傳播在內的各種生物過程都是至關重要的。例如，在真核生物中，細胞需要大量的RNA結合蛋白來控制其mRNA的含量。mRNA的代謝包括從核內合成到細胞質內降解的一系列過程，每一步都需要大量的RNA結合蛋白和核糖核蛋白（RNPs）。因此，世界各地的分子生物學實驗室對RNA-蛋白質相互作用研究的方法提出瞭越來越多的需求。特別是利用分子遺傳學或生物化學方法來識別與之前已確定的RNA目標結合的未知蛋白質，對破譯這些基本的生物過程至關重要。在這種情況下誕生瞭酵母三雜交技術。
酵母三雜原理
1996年，Wickens和Kuhl實驗室獨立開發瞭酵母三雜交系統。酵母三雜交系統的總體策略如圖9所示，該系統由兩個實驗室開發，其RNA和蛋白質成分不同(SenGupta et al., 1996；Putz et al., 1996)。該系統的原理是基於酵母細胞報告基因上遊RNA-蛋白相互作用介導的多亞基反式激活復合物的組裝。這種方法的主要優點之一在於RNA-蛋白質相互作用是在體內進行分析的。反式激活復合物由三個嵌合分子組成。第一個雜交蛋白是與DNA結合域融合的RNA結合蛋白。第二個雜交蛋白分子是一個融合蛋白，其中包含一個融合到Gal4激活域的第二個RNA結合蛋白。第三種雜交分子是一種RNA分子，通過為RNA結合蛋白提供兩個特定的RNA靶點來連接兩個融合蛋白。
在SenGupta等人1996年開發的方法中，第一個雜交分子是兩個蛋白質結構域的融合：大腸桿菌LexA DNA結合結構域（LexA DB），與LexA操作DNA序列和噬菌體MS2塗層蛋白（CP）特異性地結合。為瞭特異性識別MS2 RNA靶點，MS2 CP需要二聚體化。包含MS2靶標的雜交RNA可以與任何感興趣的RNA靶標X連接。第二個融合蛋白從一個融合到Gal4激活域的cDNA文庫中表達。如果蛋白Y可以與感興趣的RNA相互作用，這將導致一個活躍的反式激活物復合物的重組，並觸發兩個報告基因HIS3和LacZ的表達。因此，在活酵母細胞中，通過測量報告基因的表達水平，可以監測RNA X和蛋白Y之間唯一的RNA蛋白相互作用。
在Putz等人開發的方法中，第一個雜交蛋白包含與HIV-1 Rev M10變體融合的Gal4 DNA結合域。雜交RNA分子由Rev RNA靶標組成，即與感興趣的RNA X相連的Rev反應元件（RRE）。第三個雜交蛋白，Y與Gal4 AD融合，在兩個系統中是相同的。
圖9 酵母三雜交系統(Brückner et al., 2009)。（A）SenGupta等人設計的酵母三雜交系統(SenGupta et al., 1996)。第一個雜交蛋白包含LexA DNA結合域和噬菌體MS2外殼蛋白（CP）。MS2 CP必須形成二聚體才能與RNA靶點結合。第二個RNA雜交分子包含一個MS2結合位點，該位點可以與任何感興趣的RNA X相連。第三個雜交蛋白是蛋白質Y與RNA誘餌和Gal4激活域（AD）相互作用的融合蛋白。RNA X與蛋白Y的相互作用導致在17-nt LexA操作子（LexAop）上組裝成一個完整的反式激活復合物，該復合物位於兩個報告基因HIS3和LacZ的上遊。8和4個LexAop分別位於LacZ基因和HIS3基因的上遊。（B）在Putz等人1996年的系統中，第一個雜交蛋白由與HIV Rev M10突變蛋白融合的Gal4 DNA結合域組成。該蛋白與其RNA靶標，Rev反應元件（RRE）結合。第三個雜交蛋白和報告基因在兩個系統中是相同的。
酵母三雜交篩庫體系不僅可以利用RNA作為誘餌去篩選與之互作的蛋白，也可以利用蛋白作為誘餌去篩選與其互作的RNA。另外，由於某些RNA具有激活報告基因轉錄的能力，這意味著它們不需要任何AD蛋白就能觸發報告基因的表達。根據這一特性設計出瞭一種新型RNA雜交系統用於檢測RNA-RNA相互作用，其原理如下：
圖10 酵母三雜交方法的變體用於檢測RNA-RNA相互作用(Brückner et al., 2009)。這個體系包含兩個雜交RNA分子。第一種雜交與經典的三雜交方法相同，即MS2與任何感興趣的RNA X融合。第二種RNA雜交是與自反式激活RNAm26相連的特定RNA相互作用子Y之間的融合。X和Y相互作用導致HIS3和LacZ報告基因的表達。
小遠叨叨
酵母單雜與酵母雙雜是我們經常會用到的實驗，想必大傢都比較熟悉，但是膜系統酵母雙雜與酵母三雜瞭解的人應該就沒那麼多瞭，不管之前如何，今天通過伯小遠細致地講解，大傢對它們的原理應該都比較清楚瞭！看完文章有不懂的地方可以與伯小遠交流哦！另外文章中提到瞭酵母雙雜衍生出來的酵母三雜還有驗證RNA與蛋白互作的酵母三雜，很多時候名字都一樣，大傢一定要區分清楚哦！原理比較復雜，但是理解瞭就會覺得很簡單，希望大傢好好吸收，後面將繼續為大傢講解酵母雜交相關的知識及具體文獻舉例，大傢記得關註哦！
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