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gRNA——提高CRISPR基因編輯實驗效率的關鍵!

CRISPR-Cas9基因編輯技術就是通過人工設計的 sgRNA(guide RNA)來識別目的基因組序列,並引導 Cas9 蛋白酶進行有效切割 DNA 雙鏈,形成雙鏈斷裂,損傷後修復會造成基因敲除或敲入等,最終達到對基因組DNA 進行修飾的目的。

Matthew H Porteus等人在nature biotechnology上發表瞭Chemically modified guide RNAs enhance CRISPR-Cas genome editing in human primary cells,該研究通過對合成的sgRNA進行化學修飾,提高瞭人類原始T細胞和CD34+造血幹細胞和祖細胞(HSPC)的基因組編輯效率。將化學修飾的sgRNA與Cas9 mRNA或蛋白質共同遞送,是一種有效的遞送方法,而且不存在與DNA遞送相關的毒性。這是一種簡單而有效的方法,有促進CRISPR-CAS技術在生物技術和治療應用方面發展的潛力。

研究內容

為瞭測試化學合成的sgRNA用於基因組編輯的效用,作者對sgRNA進行三種不同的化學修飾,包含M、MS、MSP,加在5’和3’末端的三個核苷酸上,並評估其的最終效果。作者選擇瞭三個已經被細胞系中具有高基因編輯頻率的sgRNA靶向的人類基因:IL2RG,HBB,和CCR5。結果表明,通常情況下,化學修飾的sgRNA保持瞭高度的特異性。在靶和脫靶比率的差異表明sgRNA的化學變化具有調節活性的可能性。

為瞭進一步探索化學修飾的人類細胞系中的sgRNA,作者轉向一個全RNA遞送平臺,聯合遞送sgRNA和編碼Cas9的mRNA。並通過核轉染的方式聯合或連續遞送Cas9和各種靶向IL2RG的合成sgRNA,探索化學修飾是否對sgRNA活性的半衰期有影響。之後,作者比較瞭未修飾和MS修飾的sgRNA在脫靶位點的活性。研究發現,當化學修飾的sgRNA與Cas9 mRNA共同遞送或作為RNP遞送時,在人類細胞系中顯示出比未修飾的sgRNA更具優勢的基因編輯。

圖1 化學修飾合成的sgRNA促進人類細胞系K562中高頻率的突變和同源重組(HR)。

接下來,作者在原代細胞中測試瞭化學修飾的sgRNA,發現與質粒核轉染相比,修飾後的sgRNA對細胞存活和增殖的影響很小。還在未受刺激的T細胞中測試瞭MS修飾的sgRNA,與刺激的T細胞相比,未刺激的T細胞在供者之間表現出更高的變異性。並發現針對IL2RG和HBB的化學修飾的sgRNA在從動員的外周血中分離出來的CD34+HSPC中具有活性。

圖2 化學修飾的sgRNA促進瞭人類T細胞和CD34+造血幹細胞和祖細胞(HSPC)的高頻率基因裂解。

研究結果

在這項研究中,作者證明瞭化學合成的sgRNA可以有效地用於靶向基因組編輯,並且證明瞭化學修飾的sgRNA可以顯著提高人類原代T細胞和CD34+ HSPC的基因組編輯效率。化學合成和修飾的sgRNA比表達或體外轉錄的sgRNA更具優勢,包括:

(1)提高療效。

(2)用於生物技術和治療應用的高純度sgRNA的穩定和可持續生產。

(3)與通常分別用於sgRNA的質粒表達或體外轉錄的U6或T7啟動子對第一轉錄核苷酸施加的限制相比,sgRNA設計具有更大的靈活性,

(4)與基於DNA質粒的系統相比,在原代細胞中具有更低的細胞毒性,使一個僅具有高活性的RNA或RNP CRISPR平臺成為可能。

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